ICS65.020.01 CCSB61 46 海南省地方标准 DB46/T753—2026 土沉香（白木香）品种鉴定SSR标记法 IdentificationofAquilariasinensisvarieties－SSRmarkermethod 2026-06-12发布 2026-08-01实施 海南省市场监督管理局  发布DB46/T753—2026 I目次 前言.......................................................................II 1范围......................................................................1 2规范性引用文件.............................................................1 3术语和定义................................................................1 4缩略语....................................................................2 5原理......................................................................2 6仪器设备及试剂.............................................................2 7溶液配制..................................................................2 8引物信息..................................................................3 9参照品种及使用.............................................................3 10操作程序.................................................................3 11结果统计.................................................................5 12结果判定.................................................................5 附录A（规范性）仪器设备及试剂................................................7 附录B（规范性）溶液配制......................................................9 附录C（规范性）引物及序列...................................................11 附录D（资料性）引物相关信息.................................................12 附录E（资料性）参照品种相关信息..............................................14 附录F（资料性）土沉香品种SSR分子鉴定报告.....................................15 参考文献....................................................................16DB46/T753—2026 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由海南省林业局提出并归口。 本文件起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所、海南省林木种子（苗）总站、海口市 湿地保护管理中心、海南省林业科学研究院（海南省红树林研究院）、海南那大农业开发有限公司。 本文件主要起草人：刘培卫、魏建和、杨云、张玉秀、薛荟、甄云楠、陈波、吴海莹、董晓娜、刘 宝元。DB46/T753—2026 1土沉香（白木香）品种鉴定SSR标记法 1范围 本文件规定了利用简单重复序列（SSR）标记法进行土沉香（白木香）（Aquilariasinensis(Lour.) Spreng.）品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、参照品种及使用、操作程序、结 果统计和结果判定。 本文件适用于土沉香品种的DNA分子数据采集和品种鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 简单重复序列simplesequencerepeat；SSR 基因组中由2个及以上核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA序列。 [来源：NY/T2594—2016,3.2] 核心引物coreprimers 品种鉴定时优先选用的一组SSR引物，具有多态性高、重复性好和分布均匀的特点。 [来源：NY/T2594—2016,3.6,有修改] 扩展引物extendedprimers 核心引物检测出不同品种差异位点数小于2时可选择的一组SSR引物，具有重复性好、分布均匀的特 点。 [来源：NY/T2594—2016,3.7,有修改]DB46/T753—2026 2 参照品种referencevariety 代表核心引物主要等位变异的一组样品。用于辅助确定待测品种在某个位点上扩增片段的大小，校 正仪器设备的系统误差。 [来源：NY/T2594—2016,3.9,有修改] 对照品种controlcultivar 与待检样品近似的品种，用于与待检品种进行比对；或指已知品种中与待检品种相似度最高的品种。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 APS：过硫酸铵（AmmoniumPersulphate） bp：碱基对（BasePair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide） DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosideTriphosphates） EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid） PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）。 SSR：简单重复序列（SimpleSequenceRepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNAPolymerase） TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐-乙二胺四乙酸（Tris-Borate-EDTA） TE：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA） TEMED：四甲基乙二胺（N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine） Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)AminomethaneTHAM） 5原理 土沉香品种基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR标记，不同土沉香品种在同一SSR位点的重复次数 存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳等方法进行检测，进而区分不同的土沉香品种。 6仪器设备及试剂 仪器设备及试剂按照附录A的规定配置。 7溶液配制DB46/T753—2026 3所有用水应符合GB/T6682的要求，按照附录B的规定配置溶液。 8引物信息 引物及序列应符合附录C的规定，引物相关信息见附录D。利用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测时 选择普通引物；利用荧光毛细管进行电泳检测时选择荧光标记引物，荧光标记位于正向引物5'端。构建 数据库时，应使用全部引物；品种鉴定时，可利用附录C中的引物序贯检测，当检测到的差异位点数能 判定送检样品与对照样品不同时，停止检测。 9参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异，宜与送检样品同时检测，参照品种相关信 息见附录E。 10操作程序 样品准备 送检样品可为土沉香的嫩叶、枝条、果实等组织或器官,每份样品至少随机抽取３个单株,等量混合 分析,必要时进行个体检测。 DNA提取 取土沉香样品约200  mg，剪碎，置入2  mL的离心管中，在液氮冷冻下研磨成粉末。向研磨好的粉末 中加800  µL  CTAB提取缓冲液和50  µL  β-巯基乙醇，充分混匀。65 ℃水浴40 min后，加800 µL现配三氯甲 烷/异戊醇（24∶1），振荡混匀，10 000 g离心10 min。取上清液约500 µL至一个新的1.5 mL离心管中， 加入600 µL的预冷的异丙醇，颠倒混匀，﹣20 ℃放置30 min后，10 000 g离心10 min，弃上清液。用70% 乙醇洗涤沉淀物2遍，弃乙醇。室温晾干后，加入50 µL TE（pH 8.0）溶液溶解DNA，检测浓度和纯度。 -20 ℃保