2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 瓜 类 种 苗 种 传 病 害 检 测 技 术 规 程 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 3 1 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r d e t e c t i o n o f s e e d - t r a n s m i t t e d d i s e a s e s o f c u c u r b i t a c e o u s c r o p Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９３１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:北京市农林科学院蔬菜研究所、全国农业技术推广服务中心、北京蔬菜学会、山东 寿光市农业农村局、山东寿光蔬菜种业集团有限公司. 本文件主要起草人:徐秀兰、邱艳红、晋芳、金石桥、任雪贞、芦钰、景琦、孙全、张海军、耿丽华、夏阳、 王红阳、范立国、都明霞、韩化雨、程琳. ⅠNY/T４９３１—２０２５ 瓜类种苗种传病害检测技术规程 １　范围 本文件规定了西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、瓠瓜、西葫芦等瓜类作物重要种传病原微生物的检测流程、检测 方法、结果判定、样品及资料保存. 本文件适用于瓜类蔓枯病病原菌(Didymellabryoniae)、瓜类果斑病病原菌(Acidovoraxcitrulli)、 黄瓜细菌性角斑病病原菌(Pseudomonassyringaepv􀆰lachrymans)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber greenmottlemosaicvirus,CGMMV)、黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus,CMV)、甜瓜坏死斑点病毒 (melonnecroticspotvirus,MNSV)、南瓜花叶病毒(squashmosaicvirus,SqMV)和小西葫芦黄花叶病毒 (zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)的检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T２８０７１—２０１１　黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 GB/T３６７８１—２０１８　瓜类种传病毒检疫鉴定方法 GB/T３６８２２—２０１８　瓜类果斑病菌检疫鉴定方法 GB/T３６８５３—２０１８　黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 检测样品　workingsample 实验室的送验样品中分取用于某个检测项目的样品. ３􀆰２ 次级样品　subsample 从检测样品中分取的部分大小适宜的样品. ３􀆰３ 感染水平　infectionlevel 携带病原物的种子数量占检测种子总数的比率. ４　方法原理 微生物形态、蛋白、核酸的特征是检测鉴定种传病害的依据.根据真菌、细菌的生物学特性、寄主范围 及危害症状等进行分离培养;根据细菌、病毒的蛋白与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测;根据真菌、 细菌、病毒的特定核酸序列进行分子生物学检测.瓜类种传病害症状相关信息见附录A,病原真菌、细菌 培养形态相关信息见附录B. ５　主要仪器设备和试剂 ５􀆰１　仪器设备 １NY/T４９３１—２０２５ PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、离心机、超低温冰箱、电泳 仪、凝胶成像系统等. ５􀆰２　主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯.磷酸缓冲液(pH７􀆰０)及培养基配制按照附录C的规定执行. PCR凝胶电泳检测的反应体系试剂要求见附录D.实时荧光PCR检测反应体系试剂要求见附录E的规 定.瓜类种传病毒酶联免疫检测相关试剂按照GB/T３６７８１的规定执行. ６　取样 ６􀆰１　种子扦样 按照GB/T３５４３􀆰２进行种子扦样,送验样品量应达到病害检测样品量要求,扦样过程中应避免由扦 样用具造成的样品污染,扦取不同样品应对扦样用具进行消毒处理或更换扦样用具. 瓜类种传病害检测适用于未经过任何处理的种子样品.种子检测样品量和病害的感染水平有关,为 确保种传病害检测到的概率为９５％或９９％,可根据病害的感染水平或健康的容许水平确定检测样品量, 见附录F.可根据种子的千粒重推算出所取样品的重量. ６􀆰２　种苗取样 具有典型或疑似症状的幼苗,单株取样,加贴标识.无症状幼苗,随机采样,１０株~２０株为一组,加贴 标识. ７　检测方案 ７􀆰１　检测流程 种子扦样或种苗取样获得检测样品,根据检测的目标病害,按照图１瓜类种传病害检测流程进行 检测. 图１　瓜类种传病害检测流程 ７􀆰２　种植观察与种苗快速检测 瓜类蔓枯病、瓜类果斑病、黄瓜细菌性角斑病及瓜类病毒病均可通过种植观察方法进行检测. ２NY/T４９３１—２０２５ ７􀆰２􀆰１　种植条件 种子播种于灭菌土,环境温度控制在２４℃~３５℃,保持温室自然光照,或者人工气候室设置１２h 光照,１２h黑暗.对于瓜类蔓枯病、瓜类果斑病、黄瓜细菌性角斑病检测,环境相对湿度应保持７０％以上. 种植１８d~３０d,观察症状.瓜类病毒病症状观察时间可延长. ７􀆰２􀆰２　苗期症状观察 出苗后,定期对幼苗进行症状观察.对出现疑似症状的幼苗可按照７􀆰１􀆰３进行快速检测,典型症状见 附录A;无症状幼苗按照６􀆰２种苗取样,分组进行实验室检测. a)　瓜类蔓枯病典型症状:子叶黄褐色或青灰色圆形或不规则形斑. b)瓜类果斑病与黄瓜细菌性角斑病典型症状:子叶出现水浸状病斑,穿孔,真叶褐色至黑色病斑. c)瓜类病毒病典型症状:叶片花叶、褪绿、黄化、皱缩、畸形. ７􀆰２􀆰３　快速检测 对于有商品化免疫胶体金试纸条的病害,可按照使用说明书进行现场快速检测及初步结果判读. ７􀆰３　瓜类蔓枯病检测 ７􀆰３􀆰１　样品制备 对于种子样品,可划分为１００粒~５００粒种子的次级样品,进行分离培养检测或分子生物学检测. 对于有疑似症状的幼苗或植株样品,刮取病斑部位病原菌,进行显微镜镜检观察及分离培养检测. ７􀆰３􀆰２　分离培养检测 种子样品采用０􀆰５％次氯酸钠浸泡１０min,无菌水冲洗３遍,用灭菌滤纸吸干种子表面水分.将灭菌 滤纸置于培养皿中加入无菌水浸湿,种子间距２cm以上,置于２５℃恒温黑暗培养１０d,取出培养皿光照 条件下培养４d,待种子上长出菌落后,挑选疑似菌落,接种PDA培养基进行分离纯化. 对于幼苗或植株样品,切取病健交界处组织,表面消毒后放入PDA培养基进行病原菌分离培养. 挑取疑似菌落进行转接纯化,菌落形态特征见附录B,纯化菌株进行形态学鉴定和分子生物学检测 确认. ７􀆰３􀆰３　分子生物学检测 种子样品用微型粉碎机进行研磨,取３g~５g粉末加入液氮研磨,提取种子总DNA进行分子生物学 检测.参照７􀆰２􀆰２分离培养获得的疑似菌株,收集真菌菌丝提取DNA进行检测.DNA提取可采用 CTAB方法或商品化DNA提取试剂盒提取,提取的DNA保存在－２０℃备用. 种子样品直接提取核酸检测宜采用实时荧光PCR方法;菌株鉴定确认可采用PCR凝胶电泳检测或 实时荧光PCR检测.PCR凝胶电泳具体检测步骤参照附录C的规定执行.实时荧光PCR检测具体步 骤参照附录D的规定执行.分子生物学检测以瓜类蔓枯病菌菌株DNA为阳性对照,以双蒸水为阴性 对照. ７􀆰４　瓜类果斑病与黄瓜细菌性角斑病检测 ７􀆰４􀆰１　样品制备 对于种子样品,可划分为５００粒~１０００粒种子的次级样品,进行分离培养检测或分子生物学检测. 对于带有疑似症状的幼苗或植株,显微镜下观察病健交接处组织是否有溢菌现象.有溢菌现象,进行 分离培养、免疫学检测或分子生物学检测. ７􀆰４􀆰２　分离培养检测 种子样品用微型粉碎机轻微破碎(至２/３以上种子破碎)或直接浸提,加入适量磷酸缓冲液或无菌水, 使种子完全浸没,室温振荡４h(１００r/min左右)或４℃浸泡过夜,收集缓冲液并通过１０００r/min离心 １min~５min,去沉淀,取清液１００００r/min离心１０min,弃上清液,管中沉淀加入１mL~２mL无菌水 悬浮制成样品浸提液. 幼苗或植株样品,选取样品病健交界处的新鲜组织,用７５％的乙醇进行表面消毒晾干,切成０􀆰５cm× ０􀆰５cm左右的小块,放入装有无菌水的EP管中,涡旋振荡３０s以上,制成样品浸提液. 制备的种子或植株样品浸提液进行１０倍梯度稀释３次,用灭菌接种环蘸取样品浸提液原液在培养基 ３NY/T４９３１—２０２５ 上划线,每个梯度稀释液取１００μL涂布培养皿,重复３次.瓜类果斑病检测使用KB培养基和半选择性 EBBA培养基(或TWZ培养基),黄瓜细菌性角斑病检测使用KB培养基和NA培养基.２８℃恒温培养２ d,半选择性培养基需培养５d~８d,挑取疑似菌落(见附录B)进行转接纯化.纯化菌株进行免疫学或分 子生