2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 农 作 物 品 种 S S R 标 记 检 测 结 果 分 析 与 判 定 规 范 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 3 2 — 2 0 2 5 A n a l y s i s a n d j u d g e m e n t p r o t o c o l o f c r o p v a r i e t i e s D N A f l u o r e s c e n t S S R t y p i n g r e s u l t s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９３２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、北京市农林科学院. 本文件主要起草人:易红梅、金石桥、任雪贞、王凤格、孙全、葛建镕、景琦、任洁、王璐、刘亚维、晋芳、 王培、周洋. ⅠNY/T４９３２—２０２５ 农作物品种SSR标记检测结果分析与判定规范 １　范围 本文件规定了利用SSR荧光标记方法对农作物品种进行检测所产生结果的分析方法与作出判断的 基本规范要求. 本文件适用于农作物品种鉴定SSR荧光标记分型结果及品种鉴定结果的分析与判断. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰１１　农作物种子检验规程　第１１部分:品种质量　品种真实性鉴定 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 简单重复序列　simplesequencerepeat(SSR) 是一类由几个核苷酸(一般为１个~６个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列. ３􀆰２ 品种真实性验证　varietygenuinenessverification 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实送验样品与标注名称是否相符;在不适用于标准样品的 情况下,可用对照样品进行比较. ３􀆰３ 品种真实性身份鉴定　varietygenuinenessidentification 通过与标准样品SSR指纹数据比对或筛查,确定送验样品的真实品种名称. ３􀆰４ Bin 每个SSR位点的等位变异大小及其范围. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) rfu:相对荧光单位(relativefluorescenceunits). Tap酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) ５　分型结果的分析 ５􀆰１　分型结果的基本要求 ５􀆰１􀆰１　样本分型图谱清晰,特异峰荧光信号强度大于１００rfu,无明显非特异峰. ５􀆰１􀆰２　每一组分子量内标回归曲线正常,且每一个分子量内标峰标定正确. ５􀆰１􀆰３　等位变异的碱基大小在Bin设置范围之内. １NY/T４９３２—２０２５ ５􀆰１􀆰４　参照样品的基因分型结果正确,空白对照无等位变异峰. ５􀆰２　异常峰的分析 ５􀆰２􀆰１　pullＧup峰 ５􀆰２􀆰１􀆰１　pullＧup峰是在同一电泳孔中,由于扩增产物荧光信号强度较高,超过了仪器对不同荧光光谱的 校正阈值,不同荧光光谱互叠造成的假峰. ５􀆰２􀆰１􀆰２　pullＧup峰尖与主峰峰尖位置完全重合,峰型与主峰峰型一致,峰荧光信号强度明显低于主峰. ５􀆰２􀆰１􀆰３　pullＧup峰为假峰,不能读取.在分析基因型数据前,先检查原始数据图谱是否存在pullＧup峰, 如果存在并影响到特异峰的识别,应先进行pullＧup峰的消除. ５􀆰２􀆰１􀆰４　pullＧup峰可通过调整光谱校正参数、降低扩增产物荧光信号强度来消除. ５􀆰２􀆰１􀆰５　pullＧup峰示意图如图１所示. 图１　pullＧup峰示意图 ５􀆰２􀆰２　非特异峰 ５􀆰２􀆰２􀆰１　非特异峰可包括染料峰、荧光污染峰和伪峰. ５􀆰２􀆰２􀆰２　染料峰是由于荧光染料脱离相应引物,单独通过毛细管时产生的;荧光污染峰是由于抗菌素、维 生素、多环芳香族化合物、荧光助色物质、各种纺织染料等在５００nm~６００nm有荧光而产生的;伪峰主要 由气泡、尿素结晶或电压波动引起. ５􀆰２􀆰２􀆰３　染料峰通常较宽,并占有分型所用染料的光谱,可通过对PCR产物的纯化去除;荧光污染峰通 常比较宽,拥有较宽的荧光光谱范围,可通过有机提取法消除;伪峰通常尖耸且出现在４种颜色的相同位 置,可通过重复实验消除. ５􀆰２􀆰２􀆰４　非特异峰不是正常扩增产物,可通过人工修正删除该峰的命名. ５􀆰２􀆰２􀆰５　非特异峰示意图如图２所示. 图２　非特异峰示意图 ５􀆰２􀆰３　影子峰 ５􀆰２􀆰３􀆰１　在SSR分型图谱中,一个目标等位变异峰前片段长度增加/减少一个重复单位的位置出现一个 信号较弱的峰为影子峰.绝大部分影子峰是由于SSR扩增中出现复制滑脱,减少一个重复单位而产生, 一般峰荧光信号强度不超过目的等位变异峰的１５％. ５􀆰２􀆰３􀆰２　当一个样品的分型图谱中,全部或大部分SSR的每个等位变异峰前片段长度增加/减少一个重 ２NY/T４９３２—２０２５ 复单位的位置出现一个小峰,峰荧光信号强度与目的等位变异峰比值小于１５％,判断为影子峰. ５􀆰２􀆰３􀆰３　当分型图谱中将影子峰显示为等位变异时,可通过人工修正删除该峰的命名. ５􀆰２􀆰３􀆰４　影子峰可通过降低扩增时的样品DNA量或降低电泳上样量等来调节. ５􀆰２􀆰３􀆰５　影子峰示意图如图３所示. 图３　影子峰示意图 ５􀆰２􀆰４　连续峰 ５􀆰２􀆰４􀆰１　在SSR分型图谱中,由于SSR扩增中发生复制滑移,出现的３个以上的峰为连续峰.连续峰相 邻峰之间片段大小相差一个重复单位. ５􀆰２􀆰４􀆰２　峰荧光信号强度随碱基数增加而变强,一般片段最长的峰荧光信号强度和峰面积最大. ５􀆰２􀆰４􀆰３　连续峰读取时一般读片段最大峰的碱基数;连续峰的荧光信号强度是其所有峰的荧光信号强度 总和. ５􀆰２􀆰４􀆰４　连续峰可通过重新设计引物,降低扩增片段长度来减少. ５􀆰２􀆰４􀆰５　连续峰示意图如图４所示. 图４　连续峰示意图 ５􀆰２􀆰５　n＋１峰 ５􀆰２􀆰５􀆰１　n＋１峰是PCR反应过程中由于Taq酶在扩增片段末端自动加一个腺苷酸导致的基因分型中 出现片段大小相差１碱基的的两个峰. ５􀆰２􀆰５􀆰２　n＋１峰可根据不同位点的扩增情况,选择读左峰或者读右峰的碱基大小,一般将左峰和右峰设 置在同一个Bin内. ５􀆰２􀆰５􀆰３　n＋１峰的片段大小和峰值的荧光信号强度一般采集左峰.当右峰荧光信号强度是左边峰的１ 倍以上时,n＋１峰的荧光信号强度以右边峰为准. ５􀆰２􀆰５􀆰４　n＋１峰可通过减少DNA模板量或引物浓度,增加Taq酶浓度或采用高保真DNA聚合酶等消除. ５􀆰２􀆰５􀆰５　n＋１峰示意图如图５所示. ５􀆰２􀆰６　微变异峰 ５􀆰２􀆰６􀆰１　与完全重复的等位变异峰仅有细微差别的等位变异峰称为微变异峰.微变异峰一般与等位变 异峰相差１碱基以内. ５􀆰２􀆰６􀆰２　由于PCR扩增、毛细管电泳实验偏离产生的微变异峰,可分析其与前后已命名的Bin片段的偏 ３NY/T４９３２—２０２５ 图５　n＋１峰示意图 离情况,对微变异峰进行校正,人工修正命名. ５􀆰２􀆰６􀆰３　微变异峰可以通过更换PCR试剂、电泳缓冲液、胶和稳定室温来减少. ５􀆰２􀆰７　多等位变异 ５􀆰２􀆰７􀆰１　当试验样品来自２个或２个以上的个体,在二倍体杂交种中出现３个及以上的等位变异峰或在 常规种中出现２个及以上的等位变异峰,为多等位变异. ５􀆰２􀆰７􀆰２　当样品一致性较好时,不同个体之间基因型一致,各位点基因型为１个峰(纯合子)或２个荧光 信号强度一致的峰(杂合子).当样品一致性较差时,不同个体之间基因型不完全一致,混合样品基因型可 能出现多等位变异峰. ５􀆰２􀆰７􀆰３　在单个位点上出现多等位变异峰时,结合峰图,一般采集荧光信号强度最强的两个峰. ５􀆰２􀆰７􀆰４　混合样品基因型在DNA指纹比对时,由于样品一致性造成的多等位变异,导致位点比对结果 无法确定时,需对一致性差的位点进行个体检测,综合个体基因型和混合样品基因型进行位点比对. ５􀆰２􀆰７􀆰５　混合样品出现多等位变异基因型分析示意图如图６所示. 图６　多等位变异基因型分析示意图 ５􀆰２􀆰８　高低峰 ５􀆰２􀆰８􀆰１　在SSR分型图谱中,由于等位变异之间非等效扩增或者混合样品一致性较差,形成的荧光信号 强度不等的２个等位变异峰. ５􀆰２􀆰８􀆰２　由于等位变异间非等效扩增形成的高低峰的峰差较为固定,由样品一致性差引起的高低峰的峰 差会随着样品一致性的变化而变化. ５􀆰２􀆰８􀆰３　在高低峰基因型采集时,杂交种一般设置２０％阈值,常规种一般设置３０％阈值. ５􀆰２􀆰８􀆰４　高低峰中,荧光信号强度较低的峰的rfu值低于设定阈值时,该等位变异峰值不予采集. ５􀆰２􀆰８􀆰５　高低峰示意图如图７所示. ６　位点判定