2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 添 加 剂 酵 母 硒 中 硒 代 蛋 氨 酸 的 测 定 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 8 4 5 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f s e l e n o m e t h i o n i n e i n f e e d a d d i t i v e f e a s t s e l e n i u m Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８４５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:安琪酵母股份有限公司、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲 料质量检验检测中心(北京)]、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所. 本文件主要起草人:薛刚、肖志明、覃先武、张军民、汤超华、罗必英、陈敬帮、郑洪故、樊霞. ⅠNY/T４８４５—２０２５ 饲料添加剂酵母硒中硒代蛋氨酸的测定 １　范围 本文件描述了饲料添加剂酵母硒中硒代蛋氨酸的液相色谱原子荧光光谱联用(LCＧHGＧAFS)和液相 色谱电感耦合等离子体质谱联用(LCＧICP/MS)的测定方法. 本文件适用于饲料添加剂酵母硒中硒代蛋氨酸的测定. 本文件液相色谱原子荧光光谱联用法硒代蛋氨酸的检出限为１０mg/kg,定量限为３０mg/kg;液相 色谱电感耦合等离子体质谱联用法硒代蛋氨酸的检出限为１mg/kg,定量限为３mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　液相色谱原子荧光光谱联用法(LCＧHGＧAFS) ４􀆰１　原理 试样以蛋白酶酶解,采用液相色谱原子荧光光谱联用仪检测,外标法定量. ４􀆰２　试剂或材料 除另有规定外,所用试剂均为分析纯. ４􀆰２􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ４􀆰２􀆰２　甲醇:色谱纯. ４􀆰２􀆰３　乙酸. ４􀆰２􀆰４　盐酸:优级纯. ４􀆰２􀆰５　四甲基氢氧化铵:２５％. ４􀆰２􀆰６　三羟甲基氨基甲烷. ４􀆰２􀆰７　乙酸铵:色谱纯. ４􀆰２􀆰８　蛋白酶(ProteaseXIV型,CAS:９０３６Ｇ０６Ｇ０):酶活力≥３􀆰５U/mg(在pH７􀆰５和３７℃条件下,１mg 酶每分钟水解酪蛋白产生不少于３􀆰５μmol酪氨酸). ４􀆰２􀆰９　硒代蛋氨酸(CAS:３２１１Ｇ７６Ｇ５):纯度≥９８％. ４􀆰２􀆰１０　盐酸溶液(６mol/L):量取１００mL盐酸(４􀆰２􀆰４)缓慢加入１００mL水中,混匀,冷却后使用. ４􀆰２􀆰１１　三羟甲基氨基甲烷盐酸(TrisＧHCl)缓冲溶液(０􀆰１mol/L,pH７􀆰５):准确称取１２􀆰１１g三羟甲基 氨基甲烷(４􀆰２􀆰６),用９００mL水溶解,用盐酸溶液(４􀆰２􀆰１０)调节pH至７􀆰５,定容至１L. ４􀆰２􀆰１２　流动相:称取１􀆰１５６g乙酸铵(４􀆰２􀆰７)溶于９００mL水中,加入０􀆰１５mL四甲基氢氧化铵 (４􀆰２􀆰５),用乙酸(４􀆰２􀆰３)调节pH至５􀆰５,加入５０mL甲醇(４􀆰２􀆰２),加水定容至１L. ４􀆰２􀆰１３　硒代蛋氨酸标准储备溶液(３００μg/mL):称取１５􀆰００mg硒代蛋氨酸标准品(４􀆰２􀆰９),精确至 １NY/T４８４５—２０２５ ０􀆰０１mg,于５０mL容量瓶中,用水溶解并定容.此溶液置于０℃~４℃冰箱保存,有效期为１个月. ４􀆰２􀆰１４　硒代蛋氨酸中间溶液(３μg/mL):吸取１􀆰０mL硒代蛋氨酸标准储备液(４􀆰２􀆰１３)于１００mL容量 瓶内,用水定容,此溶液临用现配. ４􀆰２􀆰１５　硒代蛋氨酸标准工作溶液:吸取硒代蛋氨酸中间溶液(４􀆰２􀆰１４)０mL、１􀆰０mL、２􀆰０mL、４􀆰０mL、 ６􀆰０mL、８􀆰０mL、１０􀆰０mL于５０mL容量瓶内,用水定容,得到浓度分别为０μg/L、６０μg/L、１２０μg/L、 ２４０μg/L、３６０μg/L、４８０μg/L、６００μg/L的标准工作溶液. ４􀆰３　仪器设备 ４􀆰３􀆰１　液相色谱原子荧光光谱联用仪:配备硒空心阴极灯. ４􀆰３􀆰２　电子天平:感量为０􀆰１mg和０􀆰０１mg. ４􀆰３􀆰３　水浴摇床:振荡速率为１５０r/min,３７℃±１℃. ４􀆰３􀆰４　离心机:转速不低于１００００r/min. ４􀆰３􀆰５　pH计. ４􀆰３􀆰６　滤膜:水系,孔径为０􀆰４５μm ４􀆰４　样品 按GB/T２０１９５制备试样,至少２００g,粉碎使其全部过０􀆰４２mm孔径的分析筛,充分混匀,装入密闭 容器中,备用. ４􀆰５　试验步骤 ４􀆰５􀆰１　提取 平行做两份试验.称取５０mg(精确至０􀆰１mg)试样于５０mL塑料离心管内,加入５mL缓冲液 (４􀆰２􀆰１１),在９０℃水浴中加热１０min,迅速冷却至室温.加入１０mg蛋白酶(４􀆰２􀆰８),置于水浴摇床中, 在３７℃１５０r/min酶解３h.取出,１００００r/min离心１０min,上清液转移至另一离心管中,４℃暂存. 在离心后留有残渣的水解管中加入１０mg蛋白酶(４􀆰２􀆰８),再加入５mL缓冲液(４􀆰２􀆰１１),涡旋混匀 后置于水浴摇床中,在３７℃１５０r/min酶解３h.取出,１００００r/min离心１０min,上清液合并. 用水定容至２５mL,混匀、稀释、过膜后上机分析. ４􀆰５􀆰２　测定 ４􀆰５􀆰２􀆰１　液相色谱参考条件 色谱柱:C１８柱,长度２５０mm,内径４􀆰６mm,粒径５􀆰０μm,或性能相当者. 柱温:３５℃. 流速:１􀆰０mL/min. 进样量:１００μL. ４􀆰５􀆰２􀆰２　氢化物发生器参考条件 载液:１０％HCl,流速６􀆰０mL/min. 还原剂:２％NaBH４溶液,含０􀆰５％NaOH,流速４􀆰０mL/min. 载气、屏蔽气均为氩气,载气流速３００mL/min,屏蔽气流速６００mL/min. ４􀆰５􀆰２􀆰３　原子荧光光谱参考条件 负高压:２７０V. 炉温:２００℃. 主灯电流:１２０mA. 辅灯电流:１２０mA. 原子化器高度:９􀆰０mm. ４􀆰５􀆰２􀆰４　标准工作溶液和试样溶液测定 分别取标准工作溶液(４􀆰２􀆰１５)和试样溶液(４􀆰５􀆰１)上机(４􀆰３􀆰１)测定.在上述色谱条件下,硒代蛋氨 酸标准溶液色谱图见附录A中的图A􀆰１. ２NY/T４８４５—２０２５ ４􀆰５􀆰２􀆰５　定性 在相同测试条件下,以保留时间定性,试样溶液与标准工作溶液中硒代蛋氨酸的保留时间相对偏差应 在±２􀆰５％以内. ４􀆰５􀆰２􀆰６　定量 以硒代蛋氨酸的浓度为横坐标,以其色谱峰面积(响应值)为纵坐标,绘制标准曲线.标准曲线的相关 系数应不低于０􀆰９９.试样溶液中硒代蛋氨酸的响应值应在标准曲线测定的线性范围内. ４􀆰６　试验数据处理 试样中硒代蛋氨酸的含量以质量分数ω计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,按公式(１)计算. ω＝C×V×１０００ m×１０００×n (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: C　———从标准曲线查得的试样溶液硒代蛋氨酸的浓度,单位为微克每升(μg/L); V———合并后的上清液定容后的体积,单位为毫升(mL); １０００———换算系数; m———试样的质量,单位为毫克(mg); n———上机测定的试样溶液超出线性范围后进一步稀释的倍数. 测定结果以平行测定结果的算术平均值表示,保留３位有效数字. ４􀆰７　精密度 在重复性条件下,两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的２０％. ５　液相色谱电感耦合等离子体质谱法(LCＧICP/MS) ５􀆰１　原理 试样以蛋白酶酶解,采用液相色谱电感耦合等离子体质谱联用仪检测,外标法定量. ５􀆰２　试剂或材料 除另有规定外,仅使用分析纯试剂. ％１％２􀆰％３􀆰２９硒代蛋氨酸标准工作溶液:分别吸取硒代蛋氨酸中间溶液(４􀆰２􀆰１４)０􀆰０mL、０􀆰１mL、 ０􀆰２mL、０􀆰５mL、１􀆰０mL、１􀆰５mL、２􀆰０mL于１００mL容量瓶内,定容,得到浓度分别为０μg/L、３μg/L、 ６μg/L、１５μg/L、３０μg/L、４５μg/L、６０μg/L的标准工作溶液. ５􀆰２􀆰２　滤膜:水系,孔径为０􀆰２２μm. ５􀆰２􀆰３　其他:同４􀆰２. ５􀆰３　仪器设备 ５􀆰３􀆰１　液相色谱电感耦合等离子质谱联用仪:配碰撞池. ５􀆰３􀆰２　其他:同４􀆰３. ５􀆰４　样品 按GB/T２０１９５制备试样,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２mm孔径的分析筛,充分混匀,装入密 闭容器中,备用. ５􀆰５　试验步骤 ５􀆰５􀆰１　提取 同４􀆰５􀆰１. ５􀆰５􀆰２　测定 ５􀆰５􀆰２􀆰１　液相色谱参考条件 进样量:２０μL,其他同４􀆰５􀆰２􀆰１. ３NY/T４８４５—２０２５ ５􀆰５􀆰２􀆰２　质谱参考条件 雾化器:同心雾化器. 采样质量数:７８. 采