2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 恩 拉 霉 素 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 8 4 2 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f e n r a m y c i n i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( L C - M S / M S ) Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８４２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:河南省农畜水产品检验技术研究院、河南牧业经济学院. 本文件主要起草人:吴宁鹏、彭丽、李慧素、孟蕾、张盼盼、杨洁、李灵平、崔超、张晶晶、 李华玮. ⅠNY/T４８４２—２０２５ 饲料中恩拉霉素的测定　液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中恩拉霉素的液相色谱串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中恩拉霉 素(以恩拉霉素A和恩拉霉素B之和计)的测定. 本文件恩拉霉素A和恩拉霉素B的检出限均为０􀆰０５mg/kg,定量限均为０􀆰１０mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用 于本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中待测物用盐酸甲醇溶液或甲酸甲醇溶液提取,固相萃取柱净化,液相色谱串联质谱法测定, 基质匹配外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ５􀆰２　甲醇:色谱纯. ５􀆰３　甲酸:色谱纯. ５􀆰４　乙酸乙酯. ５􀆰５　盐酸溶液(０􀆰１mol/L):取盐酸４􀆰２mL,用水稀释至５００mL,混匀. ５􀆰６　盐酸甲醇溶液:移取甲醇５５mL与盐酸溶液(５􀆰５)４５mL,混匀. ５􀆰７　２％甲酸甲醇溶液:移取甲酸２mL,用甲醇稀释至１００mL,混匀. ５􀆰８　５％氨水溶液:移取氨水５mL,用水稀释至１００mL,混匀. ５􀆰９　甲醇氨水溶液:移取甲醇２０mL与５％氨水(５􀆰８)８０mL,混匀. ５􀆰１０　１％甲酸乙酸乙酯:移取甲酸１mL,用乙酸乙酯稀释至１００mL,超声混匀. ５􀆰１１　盐酸甲醇溶液(０􀆰１mol/L):移取盐酸１mL,用甲醇稀释至１２０mL,混匀. ５􀆰１２　０􀆰１％甲酸溶液:移取甲酸(５􀆰３)０􀆰５mL,用水稀释至５００mL,混匀. ５􀆰１３　复溶液:移取甲醇(５􀆰２)８０mL与０􀆰１％甲酸溶液(５􀆰１２)２０mL,混匀. ５􀆰１４　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取恩拉霉素A(CAS:３４４３８Ｇ２７Ｇ２,纯度不低于９５％)和恩 拉霉素B(CAS:３４３０４Ｇ２１Ｇ７,纯度不低于８３％)标准品各适量(折算成有效成分５mg,精确至 ０􀆰０１mg)分别于５mL容量瓶中,用甲醇(５􀆰２)溶解定容.－１８℃以下保存,有效期６个月. １NY/T４８４２—２０２５ ５􀆰１５　混合标准中间液(１００μg/mL):准确吸取恩拉霉素A和恩拉霉素B标准储备溶液各１mL于 １０mL容量瓶中,用甲醇(５􀆰２)定容,混匀.－１８℃以下保存,有效期６个月. ５􀆰１６　混合标准系列溶液Ⅰ:精密量取适量混合标准中间液(５􀆰１５),用复溶液(５􀆰１３)稀释,配制成 质量浓度分别为２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL的混合标准系 列溶液Ⅰ. ５􀆰１７　混合标准系列溶液Ⅱ:精密量取适量混合标准中间液(５􀆰１５),用２％甲酸甲醇(５􀆰７)稀释,配 制成质量浓度分别为４０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL、１０００ng/mL、２０００ng/mL、４０００ng/mL 的混合标准系列溶液Ⅱ. ５􀆰１８　固相萃取柱A:填料为改性苯乙烯二乙烯基苯聚合物,２００mg/３mL,或性能相当者. ５􀆰１９　固相萃取柱B:填料为极性脲基改性苯乙烯二乙烯基苯共聚物,２００mg/６mL,或性能相当者. ５􀆰２０　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源. ６􀆰２　分析天平:精度为０􀆰０１g和０􀆰０１mg. ６􀆰３　离心机:转速不低于１００００r/min. ６􀆰４　涡旋振荡器. ６􀆰５　涡旋混合器. ６􀆰６　固相萃取装置. ６􀆰７　超声波清洗器. ６􀆰８　氮吹仪. ７　样品 按GB/T２０１９５制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的试验筛,充分混匀, 装入密闭容器中,备用.选取类型相同,均匀一致且在待测物保留时间处,仪器响应值小于方法定量限 ３０％的饲料样品,作为空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 ８􀆰１􀆰１　配合饲料、浓缩饲料和精料补充料 平行做两份试验.称取试样２g(精确至０􀆰０１g)于５０mL离心管中,准确加入盐酸甲醇溶液 (５􀆰６)２０mL,涡旋混匀,超声提取３０min,涡旋振荡１０min,１００００r/min离心５min.准确移取 １mL上清液,加入盐酸溶液(５􀆰５)１０mL,涡旋混匀,备用. ８􀆰１􀆰２　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 平行做两份试验.称取试样２g(精确至０􀆰０１g)于５０mL离心管中,准确加入２％甲酸甲醇溶液 (５􀆰７)２０mL,涡旋混匀,超声３０min,涡旋振荡１０min,１００００r/min离心５min,上清液备用. ８􀆰２　净化 ８􀆰２􀆰１　配合饲料、浓缩饲料和精料补充料 依次用甲醇５mL、水５mL活化固相萃取柱A(５􀆰１８),将全部备用液(８􀆰１􀆰１)过柱,待溶液全部 流出之后,用甲醇氨水溶液(５􀆰９)５mL淋洗,抽干１min,再用１％甲酸乙酸乙酯(５􀆰１０)５mL淋 洗,抽干２min.用盐酸甲醇溶液(５􀆰１１)６mL洗脱,抽干１min,洗脱液于４０℃下氮气吹干,准确 加入１mL复溶液(５􀆰１３),超声１min,涡旋混匀,过微孔滤膜(５􀆰２０)后待测. ２NY/T４８４２—２０２５ ８􀆰２􀆰２　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 移取２mL备用液(８􀆰１􀆰２)通过固相萃取柱B(５􀆰１９),收集流出液,涡旋混匀,过微孔滤膜 (５􀆰２０),待测. ８􀆰３　基质匹配标准系列溶液的制备 ８􀆰３􀆰１　配合饲料、浓缩饲料和精料补充料 取空白试样,按８􀆰１和８􀆰２处理至氮气吹干,准确移取混合标准系列溶液Ⅰ(５􀆰１６)各１mL溶解 残余物,配制成质量浓度分别为２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL 的基质匹配标准系列溶液Ⅰ. ８􀆰３􀆰２　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 取空白试样,按８􀆰１和８􀆰２处理得到空白基质溶液,准确移取混合标准系列工作液Ⅱ(５􀆰１７)各 ５０μL,加空白基质溶液稀释至１mL,配制成质量浓度分别为２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、 １００ng/mL、２００ng/mL的基质匹配标准系列溶液Ⅱ. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰８μm,或性能相当者; b)柱温:３５℃; c)流速:０􀆰３mL/min; d)进样量:５mL; e)流动相:A相为０􀆰１％甲酸溶液(５􀆰１２),B相为甲醇(５􀆰２),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间 minA相 ％B相 ％ ０ ９０ １０ １􀆰５ ５０ ５０ ３􀆰３ ３０ ７０ ３􀆰５ ５ ９５ ４􀆰４ ５ ９５ ４􀆰５ ９０ １０ ６􀆰０ ９０ １０ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)检测方式:多反应监测(MRM); c)喷雾电压:３􀆰０kV; d)离子源温度:１５０℃; e)脱溶剂气温度:５００℃; f)锥孔气流速:１５０L/h; g)脱溶剂气流速:１０００L/h; 多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值见表２. ３NY/T４８４２—２０２５ 表２　多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 待测物名称监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 eV 恩拉霉素A７８５􀆰８＞１０８９􀆰０a ７８５􀆰８＞９５􀆰１３０２２ ３０ 恩拉霉素B７９０􀆰７＞１０８９􀆰１a ７９０􀆰７＞９５􀆰０３０２２ ３０ 　　a　为定量离子. ８􀆰４􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 ４１􀆰在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(８􀆰３)和试样溶液(８