2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 猪 丁 型 冠 状 病 毒 感 染 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 8 2 0 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r p o r c i n e d e l t a c o r o n a v i r u s d i s e a s e Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８２０—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)提出并归口. 本文件起草单位:河南农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、华中农业大学. 本文件主要起草人:胡慧、魏战勇、邵卫星、方六荣、郑兰兰、张红垒、张峰、夏璐、张越、祖少坡、袁晋、项 玉强、靳晓慧、郭东辉. ⅠNY/T４８２０—２０２５ 引　　言 猪丁型冠状病毒感染(porcinedeltacoronavirusdisease)是由猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus, PDCoV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病,临床上以１０日龄内的仔猪发生腹泻、呕吐、脱水为主要 特征.在仔猪腹泻样品中,PDCoV检出率高达２０％~６０％.该病一年四季均可发生,其中冬春季为高发 季节.病猪、带毒猪和隐性感染猪是本病的主要传染源.病毒主要通过粪口途径进行传播. PDCoV属于套式病毒目、冠状病毒科、δ冠状病毒属成员. ⅡNY/T４８２０—２０２５ 猪丁型冠状病毒感染诊断技术 １　范围 本文件规定了猪丁型冠状病毒感染的临床诊断、样品采集与处理,以及病毒分离与鉴定、间接免疫荧 光试验(IFA)、TaqMan荧光定量RTＧqPCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)等实验室诊断方法的技术要求. 本文件适用于新生仔猪的猪丁型冠状病毒感染的诊断、检测、检疫、监测和流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和实验方法 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 GB/T２７４０１　实验室质量控制规范动物检疫 NY/T５４１—２０１６　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BSA:牛血清白蛋白(bovineserumalbumin) bp:碱基对(basepair) CPE:致细胞病变效应(cytopathiceffect) Ct值:循环阈值(cyclethreshold) cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) DMEM:杜氏培养基(dulbecco’smodifiedeaglemedium) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay) FITC:异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate) IFA:间接免疫荧光(indirectimmunofluorescenceassay) IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinG) LLCＧPK１细胞:猪肾细胞(porcinekidneyepithelialcells１,LLCＧPK１) MEM:最低必需培养液(minimalessentialmedium) OD:光密度(opticaldensity) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline) PBST:含吐温Ｇ２０的磷酸盐缓冲液(phosphateＧbufferedsalinewithtweenＧ２０) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) PDCoV:猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RTＧqPCR:反转录实时荧光定量PCR(reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction) １NY/T４８２０—２０２５ ５　临床诊断 ５􀆰１　易感动物 家猪是PDCoV的易感动物,各年龄段猪均可感染,主要危害１０日龄以内的新生仔猪. ５􀆰２　临床症状 发病仔猪以腹泻、呕吐、脱水为特征.粪便为黄色、灰黄色稀粪,严重可呈水样腹泻;呕吐物多为白色 未消化的凝乳状液体;发病仔猪精神萎靡不振、倦怠、畏寒;全身被毛杂乱、无光泽;食欲减退,病程后期严 重脱水,体重下降明显. ５􀆰３　病理变化 ５􀆰３􀆰１　剖检病理变化:感染仔猪胃内充满未消化的凝乳块;十二指肠、空肠和回肠肠壁变薄,部分肠管扩 张呈半透明状,充满大量黄色的液体;肠系膜充血严重. ５􀆰３􀆰２　组织病理学变化:十二指肠腺体减少,黏膜下层及肠壁变薄;空肠损伤最严重,肠绒毛大量脱落,黏 膜下层增厚;回肠肠绒毛变短、萎缩、脱落,杯状细胞减少,淋巴滤泡体积减小、数量减少;不同肠段绒毛高 度与隐窝深度之比有不同程度的降低. ５􀆰４　临床判定 ５􀆰４􀆰１　新生仔猪出现５􀆰２的临床症状或５􀆰３的病理变化,可临床判定为PDCoV感染疑似病例. ５􀆰４􀆰２　进一步确诊应采集腹泻仔猪的血清、粪便、小肠组织及内容物等样品.如有可能,应同时采集同一 流行病学单元内其他未见明显临床症状仔猪的血清、粪便、小肠组织及内容物进行实验室诊断. ６　样品的采集与处理 ６􀆰１　采样用具 ６􀆰１􀆰１　器械:解剖刀、剪刀、镊子、药匙、注射器及针头、组织匀浆器等. ６􀆰１􀆰２　容器:离心管、样品保存管等. ６􀆰１􀆰３　个人防护用具:防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等. ６􀆰１􀆰４　其他:微孔滤器、采样单、记号笔、防水标签、封口膜、冰袋等. ６􀆰２　试剂材料 ６􀆰２􀆰１　DMEM. ６􀆰２􀆰２　青霉素,浓度为１００００IU/mL. ６􀆰２􀆰３　链霉素,浓度为１００００μg/mL. ６􀆰３　样品采集 ６􀆰３􀆰１　组织样品:用无菌剪刀剪取发病仔猪的小肠组织０􀆰５g~１􀆰０g组织作为待检样品,放置于离 心管. ６􀆰３􀆰２　粪便及肠内容物样品:用无菌的药匙,刮取新鲜粪便及肠内容物,放置于离心管. ６􀆰３􀆰３　血液样品:用无菌注射器采集发病猪或感染猪血液. ６􀆰４　样品处理 ６􀆰４􀆰１　组织样品:采集的肠组织(经剪碎处理),按１∶５的比例加入终浓度为１００IU/mL青霉素、 １００μg/mL链霉素的DMEM细胞培养液,反复研磨至糊状,将研磨好的病料反复冻融３次,４℃３０００r/min 离心２０min,上清液用０􀆰２２μm微孔滤器过滤,收集样品滤液. ６􀆰４􀆰２　粪便及肠内容物样品:采集的粪便或肠内容物,按１∶５的比例加入终浓度为１００IU/mL青霉素、 １００μg/mL链霉素的DMEM细胞培养液,振荡混匀,４℃３０００r/min离心２０min,上清液用０􀆰２２μm微 孔滤器过滤,收集样品滤液. ６􀆰４􀆰３　血液样品:采集的猪血液(不加抗凝剂)室温下静置２h,３０００r/min离心１０min,收集血清. ２NY/T４８２０—２０２５ ６􀆰５　存放与运输 采集的样品与冰块或干冰一起放入保温箱密封,在保温箱外喷洒消毒液,立即送到实验室检测.处理 后样品在４℃~８℃条件下保存应不超过２４h;若需长期保存,应放置于－８０℃冰箱,避免反复冻融. ７　病毒分离与鉴定 ７􀆰１　仪器设备 ７􀆰１􀆰１　生物安全柜. ７􀆰１􀆰２　恒温CO２培养箱. ７􀆰１􀆰３　显微镜. ７􀆰１􀆰４　台式低温高速离心机. ７􀆰１􀆰５　漩涡振荡器. ７􀆰１􀆰６　可调微量移液器(１０μL、２００μL、１０００μL等不同规格). ７􀆰２　试剂材料 ７􀆰２􀆰１　PBS,按照附录A中的A􀆰１配制. ７􀆰２􀆰２　细胞培养溶液,按照A􀆰２配制. ７􀆰２􀆰３　细胞维持溶液,按照A􀆰３配制. ７􀆰３　病毒分离 ７􀆰３􀆰１　在６孔细胞培养板中接种LLCＧPK１细胞悬液,置于３７℃５％CO２培养箱中培养,约２４h后细胞 长至单层. ７􀆰３􀆰２　弃去细胞培养溶液,PBS洗２遍,每孔加入４００μL６􀆰４的样品滤液,３７℃５％CO２培养箱吸附１ h后,弃去未吸附的样品,PBS洗２遍. ７􀆰３􀆰３　每孔加入２mL含５μg/mL胰酶的细胞维持溶液,３７℃５％CO２培养箱中培养,逐日观察细胞病 变情况. ７􀆰３􀆰４　若出现细胞病变,待６０％细胞脱落时,将细胞培养板放置－８０℃冰箱,反复冻融３次,收集病毒 液;若无细胞病变,感染后４d将细胞培养板放置－８０℃冰箱,反复冻融３次,再盲传２代~３代. ７􀆰３􀆰５　同时设置两个细胞孔作为阴性对照(不接种病料上清液,只加入含５μg/mL胰酶的细胞