2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 小 麦 田 山 羊 草 属 杂 草 抗 药 性 监 测 技 术 规 程 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 7 6 6 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r h e r b i c i d e r e s i s t a n c e m o n i t o r i n g o f A e g i l o p s s p p . i n w h e a t f i e l d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７６６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:中国农业科学院植物保护研究所、全国农业技术推广服务中心. 本文件主要起草人:崔海兰、张帅、李香菊、王云鹏、于海燕、陈景超、何胜龙、刘芷含、赵鹤. ⅠNY/T４７６６—２０２５ 小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术规程 １　范围 本文件规定了小麦田山羊草属杂草(Aegilopsspp􀆰)抗药性监测的基本方法. 本文件适用于小麦田山羊草属杂草对除草剂的抗性监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T１１５５􀆰３　农药室内生物测定试验准则　除草剂　第３部分:活性测定试验　土壤喷雾法 NY/T１１５５􀆰４　农药室内生物测定试验准则　除草剂　第４部分:活性测定试验　茎叶喷雾法 NY/T３５４３—２０２０　小麦田看麦娘属杂草抗药性监测技术规程 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　技术流程 小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术流程见图１. 图１　技术流程 ５　试剂与材料 ５􀆰１　监测对象 节节麦(AegilopstauschiiCoss􀆰)、圆柱山羊草(AegilopscylindricaHost)等山羊草属杂草. １NY/T４７６６—２０２５ ５􀆰２　试验药剂 待测除草剂原药或制剂. ５􀆰３　其他试剂 除非另有说明,所用试剂均为分析纯.实验室用水符合GB/T６６８２规定的二级水要求. ６　主要仪器和设备 ６􀆰１　分析天平:感量为０􀆰００１g. ６􀆰２　喷雾设备:压力稳定,带扇形喷头的可定量喷雾装置. ６􀆰３　温度和光照可控温室:温度范围为１５℃~２５℃,光照强度不小于３００００lx. ６􀆰４　PCR扩增仪:升降温速度＞１􀆰５℃/s,孔间温度差异＜１􀆰０℃. ６􀆰５　电泳槽、电泳仪等电泳装置. ６􀆰６　凝胶成像系统. ７　试验步骤 ７􀆰１　杂草种子采集与保存 在山羊草属杂草发生危害的麦田设立采样点,根据杂草在田间的分布情况,采用倒置“W”九点取样、 五点取样或“Z”字取样等方法,采集成熟的山羊草属杂草种子,每个点采集杂草株数不少于３０株,将几个 点采集的种子混合,作为一个种群,记录采集信息(见附录A).将采集的种子晾干,并置于阴凉干燥处 保存. ７􀆰２　试材培养 选择无山羊草属杂草种子、无除草剂残留的农田地表土,混合２０％~３０％的草炭土,混合均匀后装入 直径不小于１０cm的培养钵;将待测种群及敏感对照的种子,用清水浸泡２４h后,每个培养钵定量均匀撒 播在土壤表面,覆土１􀆰５cm~２􀆰０cm,待测除草剂为土壤处理剂时需要严格定量播种.采用盆钵底部渗 灌方式补充水分,使每个营养钵内土壤相对湿度保持一致;置于２５℃(昼)/１５℃(夜),光照时间１２h条 件下培养. ７􀆰３　药剂处理 ７􀆰３􀆰１　茎叶处理法 待植株长至２叶期间苗,保留长势一致的植株,每个培养钵保留植株数量相同,一般不少于１５株,待 供试杂草长至３叶１心期茎叶喷雾施药.以待测药剂的田间推荐剂量为基准,在预实验的基础上,设计至 少５个系列剂量梯度的除草剂处理,并以不含除草剂(含有溶剂、乳化剂)的处理作为空白对照.每个剂量 不少于３次重复.处理后按照７􀆰２培养条件继续培养.在施药后１４d~２１d,调查每个处理的存活植株 数、地上部分鲜重或干重. ７􀆰３􀆰２　土壤处理法 在播种后出苗前进行土壤喷雾处理.以待测药剂的田间推荐剂量为基准,在预实验的基础上,设计至 少５个系列剂量梯度的除草剂处理,并以不含除草剂(含有溶剂、乳化剂)的处理作为空白对照.每个剂量 不少于３次重复.处理后按照７􀆰２培养条件继续培养.在施药后２１d~２８d,调查每个处理的存活植株 数、地上部分鲜重或干重. ７􀆰４　靶标基因检测 ７􀆰４􀆰１　DNA提取 确认有抗药性的植株,取叶片提取总DNA.每个种群随机检测抗药性植株不少于１０株,并单株 检测. ７􀆰４􀆰２　聚合酶链式反应(PCR) 根据靶标基因编码区序列设计引物,通过PCR反应扩增靶标基因序列. ２NY/T４７６６—２０２５ ７􀆰４􀆰３　PCR产物测序 PCR产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化,纯化后的PCR产物测序. ８　数据统计与分析 ８􀆰１　存活率计算 按公式(１)计算杂草存活率. E＝Nx N０×１００ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: E———存活率的数值,单位为百分号(％); Nx———除草剂剂量Xga􀆰i􀆰/hm２处理后存活植株数的数值,单位为株; N０———除草剂剂量Xga􀆰i􀆰/hm２处理前总株数的数值,单位为株. ８􀆰２　生长抑制中量计算 按公式(２)计算杂草鲜重或干重抑制率. Y＝M０－Mx M０×１００ (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: Y———鲜重或干重抑制率的数值,单位为百分号(％); M０———对照地上部分鲜重或干重的数值,单位为克(g); Mx———除草剂剂量Xga􀆰i􀆰/hm２处理后地上部分鲜重或干重的数值,单位为克(g). 用杂草鲜重或干重抑制率与对应的处理剂量按公式(３)或公式(４)拟合回归方程,并计算生长抑制 中量. Y′＝a＋bX (３) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: Y′———鲜重或干重抑制率概率值; a———截距; b———斜率; X′———除草剂有效剂量的对数值. Y＝C＋D－C １＋(X/GR５０)b(４) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: C———Y值下限的数值,单位为百分率(％); D———Y值上限的数值,单位为百分率(％); X———除草剂有效剂量的数值,单位为克有效成分每公顷(ga􀆰i􀆰/hm２); GR５０———生长抑制中量的数值,单位为克有效成分每公顷(ga􀆰i􀆰/hm２). ８􀆰３　抗药性水平计算 按公式(５)计算抗药性指数. RI＝GR５０R GR５０S(４) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: RI———抗药性指数; GR５０R———测试种群的GR５０; GR５０S———敏感种群的GR５０. ８􀆰４　靶标基因序列比对分析 ３NY/T４７６６—２０２５ 测序结果与敏感对照序列进行比对,并以已报道的突变位点为参考,分析靶标序列突变位点. ９　抗药性水平的评估 ９􀆰１　抗药性水平分级 通过公式(１)计算在敏感对照全部死亡的剂量及更高剂量下存活率,可以初步判断种群中抗药性植株 所占比例;根据公式(５)计算的RI值评估该种群的抗药性水平,根据表１中抗药性水平分级标准分为低、 中、高水平抗药性. 表１　杂草抗药性水平的分级标准 抗药性水平分级 抗药性指数 低水平抗药性 ２􀆰０＜RI≤５􀆰０ 中等水平抗药性 ５􀆰０＜RI≤１０􀆰０ 高水平抗药性 RI＞１０􀆰０ ９􀆰２　靶标抗性判断 通过生物测定确认有抗药性,且通过靶标基因检测在对应已报道的抗药性位点发生突变时,即判断为 靶标抗性,在保守区发现新的突变位点时,需进一步检测确认. ４NY/T４７６６—２０２５ 附　录　A (资料性) 杂草种子采集信息登记表 　 杂草种子采集信息登记表见表A􀆰１. 表A􀆰１　杂草种子采集信息登记表 　　样品编号: 采样人:　　　　　　　　采集单位:　　　　　采样日期:　　　　　　年　　　　　　月　　　　　　日 采样点详细地址　　　　省(自治区、直辖市)　　　　县　　　　乡　　　　村 农户姓名:　　　　　电话:　　　　 杂草名称 定位信息 经度:　　　　　纬度:　　　　 种植模式耕作方式(打√):□免耕　□浅旋　□深翻 前茬作物:　　　　 除草剂使用背景除草剂使用情况: 近５年使用:　　　　;用量:　　　　ga􀆰i􀆰/hm２,　　　　次/年 近１０年使用:　　　　;用量:　　　　ga􀆰i􀆰/hm２,　　　　次/年 除草剂药效当季使用:　　　　;用量:　　　　ga􀆰i􀆰/hm２,　　　　次/年 效果(打√):□好　□一般　□差 ５