2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 桑 叶 中 1 - 脱 氧 野 尻 霉 素 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 7 6 3 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f 1 - D e o x y n o j i r i m y c i n ( D N J ) i n m u l b e r r y l e a f - H i g h p e r f o r m a n c e — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t e n d e m m a s s s p e c t o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７６３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由全国桑蚕业标准化技术委员会(SAC/TC４３７)提出并归口. 本文件起草单位:江苏科技大学、农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心(镇江)、中国农业 科学院蚕业研究所、四川省农业科学院蚕业研究所、湖北省农业科学院经济作物研究所、广东省农业科学 院蚕业与农产品加工研究所、广西蚕业技术推广站、西南大学. 本文件主要起草人:张东阳、陈涛、姚晓慧、刘利、赵卫国、杨佳昕、佟万红、于翠、黄盖群、罗国庆、林强、 赵爱春. ⅠNY/T４７６３—２０２５ 桑叶中１Ｇ脱氧野尻霉素的测定　高效液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件规定了桑叶及以桑叶为原料的加工产品中１Ｇ脱氧野尻霉素含量测定的高效液相色谱串联质 谱测定方法的原理、试剂和材料、仪器、试样制备、分析步骤、结果计算和精密度. 本文件适用于桑叶及以桑叶为原料的加工产品中１Ｇ脱氧野尻霉素的测定. 本文件１Ｇ脱氧野尻霉素线性范围为０􀆰０２mg/L~５０mg/L,检出限为０􀆰１５mg/kg,定量限为 ０􀆰４５mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 桑叶及以桑叶为原料的加工产品中的１Ｇ脱氧野尻霉素经乙醇水溶液超声提取后,用微孔过滤膜过 滤,以乙腈甲酸溶液和甲酸水溶液作为流动相,使用HILIC亲水保留色谱柱,用高效液相色谱串联质谱 仪进行测定,外标法定量. ５　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂,水为GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　乙腈(C２H３N,CAS:７５Ｇ０５Ｇ２):色谱纯. ５􀆰１􀆰２　甲酸(CH２O２,CAS:６４Ｇ１８Ｇ６):色谱纯. ５􀆰１􀆰３　甲醇(CH４O,CAS:６７Ｇ５６Ｇ１):色谱纯. ５􀆰１􀆰４　乙醇(C２H６O,CAS:６４Ｇ１７Ｇ５). ５􀆰１􀆰５　提取剂:乙醇＋水＝７０＋３０(V＋V),取７００mL乙醇(５􀆰１􀆰４)和３００mL水,混匀. ５􀆰１􀆰６　流动相A:乙腈＋甲酸＝９９９＋１(V＋V),取９９９mL乙腈(５􀆰１􀆰１)和１mL甲酸(５􀆰１􀆰２),混匀. ５􀆰１􀆰７　流动相B:水＋甲酸＝９９９＋１(V＋V),取９９９mL水和１mL甲酸(５􀆰１􀆰２),混匀. ５􀆰２　标准品 １Ｇ脱氧野尻霉素标准品(１ＧDeoxynojirimycin,C６H１３NO４,CAS:１９１３０Ｇ９６Ｇ２)相对分子质量为１６３􀆰１７, HPLC≥９８％.１Ｇ脱氧野尻霉素标准品的结构式见附录A. ５􀆰３　标准溶液配制 ５􀆰３􀆰１　１Ｇ脱氧野尻霉素标准储备液:准确称取１Ｇ脱氧野尻霉素标准品(５􀆰２)１mg(精确至０􀆰０１mg),用甲 醇(５􀆰１􀆰３)溶解并定容至１０mL,配制成质量浓度为１００mg/L的标准储备液,密封储存于Ｇ２０℃冰箱内, 可使用６个月. ５􀆰３􀆰２　１Ｇ脱氧野尻霉素标准工作溶液:取１Ｇ脱氧野尻霉素标准储备液(５􀆰３􀆰１)用甲醇(５􀆰１􀆰３)溶液稀释, １NY/T４７６３—２０２５ 并配制成质量浓度为０􀆰２mg/L、１􀆰０mg/L、５􀆰０mg/L、１０􀆰０mg/L、２０􀆰０mg/L、３０􀆰０mg/L、４０􀆰０mg/L、 ５０􀆰０mg/L的标准工作溶液,现用现配. ６　仪器和设备 ６􀆰１　高效液相色谱串联质谱仪:配备电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　超声波提取器. ６􀆰３　分析天平:感量０􀆰０１g和０􀆰００００１g. ６􀆰４　粉碎机. ６􀆰５　组织捣碎机. ６􀆰６　旋转蒸发仪. ６􀆰７　有机相微孔滤膜:０􀆰２２μm. ７　试验方法 ７􀆰１　试样制备 ７􀆰１􀆰１　干桑叶:放入粉碎机中粉碎,采用四分法分取样品,样品全部过６０目的标准网筛. ７􀆰１􀆰２　鲜桑叶:采用四分法分取样品,放入组织捣碎机中匀浆. ７􀆰１􀆰３　以桑叶为原料的加工产品:固体样品放入粉碎机中粉碎,采用四分法分取样品,样品全部过６０目 的标准网筛;液体样品充分混匀后直接取样. ７􀆰２　提取 ７􀆰２􀆰１　干桑叶 称取试样２g(精确至０􀆰０１g)于５０mL锥形瓶中,加入２０mL提取剂(５􀆰１􀆰５),３０℃条件下超声提 取２０min.将试样及提取液转移至抽滤漏斗上,减压抽滤,收集滤液,残渣再以２０mL提取剂(５􀆰１􀆰５)重 复提取１次,合并两次滤液,并用提取剂(５􀆰１􀆰５)定容至５０mL(V),超声波处理２min,充分混合均匀.取 样品提取液５􀆰００mL(V１),用提取剂(５􀆰１􀆰５)定容至１００mL(V０),０􀆰２２μm有机相微孔滤膜过滤,待测. ７􀆰２􀆰２　鲜桑叶 称取试样１０g(精确至０􀆰０１g)于５００mL锥形瓶中,加入２００mL提取剂(５􀆰１􀆰５),３０℃条件下超声 提取２０min.将试样及提取液转移至抽滤漏斗上,减压抽滤,收集滤液,残渣再以２００mL提取剂(５􀆰１􀆰５) 重复提取１次,合并两次滤液,并用提取剂(５􀆰１􀆰５)定容至５００mL(V),超声波处理２min,充分混合均匀, ０􀆰２２μm有机相微孔滤膜过滤,待测. ７􀆰２􀆰３　以桑叶为原料的加工产品 固体样品:称取试样２g(精确至０􀆰０１g)于５０mL锥形瓶中,加入２０mL提取剂(５􀆰１􀆰５),在匀浆机 中匀浆２min,３０℃条件下超声提取２０min.将试样及提取液转移至抽滤漏斗上,减压抽滤,收集滤液, 残渣再以２０mL提取剂(５􀆰１􀆰５)重复提取１次,合并两次滤液,并用提取剂(５􀆰１􀆰５)定容至５０mL(V),超 声波处理２min,充分混合均匀.取样品提取液１０􀆰００mL(V１),在５０℃下减压浓缩至近干,用提取剂 (５􀆰１􀆰５)定容至１mL(V０),０􀆰２２μm有机相微孔滤膜过滤,待测. 液体样品:称取试样１０g(精确至０􀆰０１g),加水定容至１０mL(V),摇匀,静置,取上清液经０􀆰２２μm 有机相微孔滤膜过滤,待测. ７􀆰３　测定 ７􀆰３􀆰１　高效液相色谱串联质谱仪参考条件 ７􀆰３􀆰１􀆰１　高效液相色谱参考条件 a)　色谱柱:TSKgelAmideＧ８０column,２􀆰０mm×１５０mm,５μm,或相当者; b)柱温:４０℃; c)流动相:流动相A为甲酸乙腈溶液(５􀆰１􀆰６),流动相B为甲酸水溶液(５􀆰１􀆰７),高效液相色谱梯 ２NY/T４７６３—２０２５ 度洗脱条件见表１; d)流速:０􀆰２mL/min; e)进样量:２μL. 表１　高效液相色谱梯度洗脱条件 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ０ ８０ ２０ １􀆰０ ７０ ３０ ３􀆰０ ６１ ３９ ６􀆰５ ６１ ３９ ６􀆰６ ８０ ２０ １５􀆰６ ８０ ２０ ７􀆰３􀆰１􀆰２　串联质谱参考条件 a)　电离方式:电喷雾离子源(ESI),正离子模式; b)喷雾电压:４０００V; c)气化室温度:３００℃; d)鞘气压力:２５psi; e)辅助气体流速:２L/min; f)毛细管温度:２７０℃; g)扫描模式:多反应监测模式(MRM),监测离子对、碰撞气能量和套管透镜电压见表２. 表２　１Ｇ脱氧野尻霉素质谱参数 名称 母离子(M＋H),m/z 子离子,m/z 套管透镜电压,V 碰撞气能量,eV １Ｇ脱氧野尻霉素 １６４􀆰１４ １４６􀆰１５a,１２８􀆰２９ ６１ １９ 　　注:用正离子采集模式. 　　a　定量离子. ７􀆰３􀆰２　定性测定 按照７􀆰３􀆰１的仪器条件对标准工作溶液和样品提取液进行分析,将样品色谱峰的保留时间与标准品 的保留时间进行对照,样品与标准品保留时间的相对偏差不大于５％;样品特征离子与标准品各特征离子 相对照,样品特征离子的相对丰度与标准品的相对丰度偏差不超过表３的规定,则可判定样品中含有１Ｇ 脱氧野尻霉素. 表３　定性测定时相对离子丰度最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 允许相对偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ７􀆰３􀆰３　定量测定 采用外标法定量测定.测定标准工作溶液,以峰面积为纵坐标,对应的标准工作溶液浓度为横坐标, 绘制标准工作曲线. 取样