2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 辣 椒 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 2 4 7 5 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f c h i l i v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 ´úÌæ N Y / T 2 4 7 5 — 2 0 1 3NY/T２４７５—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　引物分组 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T２４７５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件代替NY/T２４７５—２０１３«辣椒品种鉴定技术规程　SSR分子标记法»,与NY/T２４７５—２０１３ 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了S６９(４号染色体)、CAMS０７１(５号染色体)、HpmsE０１５(５号染色体)、CAMS３９６(６号染 色体)、S８２(６号染色体)、Hpms１Ｇ４３(８号染色体)、CAeMS０１５(９号染色体)、Hpms２Ｇ４１(９号染 色体)、S１３３(１０号染色体)、HpmsE１４９(１１号染色体)、SSR８２(１２号染色体)、HpmsE１２８(１２号 染色体)１２对引物及相应的等位变异和参照品种; b)删除了Es２１２(１号染色体)、EPMS６９７(２号染色体)、Es２０１(２号染色体)、Es１０５(３号染色体)、 Es７２１(３号染色体)、Es１３３(９号染色体)、Es２９２(９号染色体)、Hpms１Ｇ１０６(定位不明)８对引物 及相应的等位变异和参照品种. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所、农业农村部科技发展中心、云南省 种子管理站. 本文件主要起草人:胡强、滕彩玲、韩瑞玺、汤霭娅、沈任飞、乔菊香、姚宗泽、赵秦、马莹雪、荆若男、 刘艳芳、杨晓洪、毛进. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１３年首次发布为NY/T２４７５—２０１３; ———本次为第一次修订. ⅡNY/T２４７５—２０２５ 　 　 　辣椒品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行辣椒(Capsicumspp􀆰)品种鉴定的原理、主要仪器设 备及试剂、溶液配置、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与表述. 本文件适用于辣椒品种的DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate). bp:碱基对(basepair). CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA). TE:三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′ＧTetramethylethylenediamine). Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM]. ５　原理 辣椒基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR位点,不同辣椒品种在同一SSR位点的重复次数可能 存在差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳等方法进行检测,进而通过一组SSR引物组合区分不同的辣 椒品种. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. １NY/T２４７５—２０２５ ７　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ８　引物信息及使用 引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时选择普 通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端,推荐的荧光标记见 附录D.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时,停 止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送验样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.种子不少于１００粒,需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２ 的要求.试验样品不少于３０个个体,等量混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 样品研磨后取２００mg置于２􀆰０mL圆底离心管中;每管加入６００μL预热到６５℃的CTAB提取液, 充分混合,６５℃水浴４５min~６０min,每隔１５min轻缓颠倒混匀,水浴后１２０００r/min离心１０min.吸 取上清液转移至新的离心管中,每管加入与上清液等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液(体积比V∶V为 ２４∶１),轻缓混匀后静置１０min,１２０００r/min离心１０min.吸取上清液转移至新的离心管中,加入与上 清液等体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀,－２０℃放置３０min,DNA沉淀后１２０００r/min离心１０min. 弃上清液,用７００μL７５％的乙醇溶液洗涤２遍,弃乙醇,室温晾干,加入１００μLTE缓冲液充分溶解,检测 DNA浓度和纯度,－２０℃保存备用. 注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本文件.DNA 溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１􀆰７~２􀆰０.