2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 大 麦 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 2 0 C C S B 2 4 6 6 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f b a r l e y v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 ´úÌæ N Y / T 2 4 6 6 — 2 0 1 3NY/T２４６６—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 １６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　引物分组 １８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T２４６６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的 规定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件代替NY/T２４６６—２０１３«大麦品种鉴定技术规程　SSR分子标记法»,与NY/T２４６６—２０１３ 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　推荐引物增加到３５对,保留了原来２６对引物,删除了原来２对引物,新增了９对引物; b)增加了结果表述条目; c)调整了１５对引物的等位变异; d)调整了１５对引物的参照品种. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:江苏省农业科学院、农业农村部科技发展中心. 本文件主要起草人:王艳平、马莹雪、于堃、沈奇、张凯淅、刘晓宏、潘红、王显生、李华勇、汪鸿星. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１３年首次发布为NY/T２４６６—２０１３; ———本次为第一次修订. ⅡNY/T２４６９—２０２５ 大麦品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)分子标记进行大麦原变种(Hordeumvulgarevar􀆰vulgare L􀆰)和青稞变种(Hordeumvulgarevar􀆰nudumL􀆰)品种鉴定的原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引 物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与表述. 本文件适用于大麦原变种和青稞变种的DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair). SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). ５　原理 大麦品种基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR标记,不同大麦品种在同一SSR的重复次数存在 差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,进而区分不同的大麦品种. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. ７　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ８　引物信息及使用 引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时选择普通引物; １NY/T２４６９—２０２５ 利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端,推荐的荧光标记见附录D. 可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时,停止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送验样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.种子样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的要求.每 份样品不少于１０个个体,等量混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 取大麦的幼苗或叶片０􀆰５g,剪碎,放入２mL离心管中,往离心管中加入液氮,放入研磨仪,磨成粉状 后立即加入８００μL预热的SDS提取液,剧烈摇动混匀,并在６５℃水浴中保温３０min~５０min,其间可摇 动几次.冷却至室温加入等体积三氯甲烷异戊醇(２４∶１,V∶V),轻缓颠倒混匀,室温下静置５min~ １０min,使水相和有机相分层.１２０００r/min离心１０min.移取上清液至另一２mL离心管中,加入约 １􀆰５倍体积的预冷乙醇,轻缓颠倒混匀,经１２０００r/min离心３min至分相,弃上清液.用７０％乙醇溶液 洗涤２遍,自然条件下干燥后,加入５０μL１×TE缓冲液溶解沉淀.用紫外分光光度计检测DNA浓度与 纯度,将DNA稀释到２０ng/μL.置于－２０℃保存备用. 注:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法都适用于本文件.DNA 溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１􀆰７~２􀆰０. １０􀆰３　PCR扩增 １０􀆰３􀆰１　反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和各组分的浓度参照表１配制,可以依据试验条件调整. 表１　PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐反应体积,μL １０×缓冲液(含MgCl２) １０× １× ２􀆰０ dNTPs ２􀆰５mmol/L ０􀆰２mmol/L １􀆰６ Taq酶 ５U/μL ０􀆰０５U/μL ０􀆰２ 正向引物 ５μmol/L ０􀆰２５μmol/L １􀆰０ 反向引物 ５μmol/L ０􀆰２５μmol/L １􀆰０ DNA ２５ng/μL ２􀆰５ng/μL ２􀆰０ 双蒸水 — — １２􀆰２ 总体积 ２０􀆰０ １０􀆰３􀆰２　反应程序 推荐反应程序为:９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,４７℃~６２℃(可根据附表D推荐的引物设定退 火温度)退火３０s,７２℃延伸１min,共３５个循环;７２℃延伸５min,４℃保存. 反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而作适当的调整. １０􀆰４　PCR产物电泳 １０􀆰４􀆰１　垂直板变性PAGE １０􀆰４􀆰１􀆰１　制胶 将玻璃板清洗干净,再用双蒸水、无水乙醇分别擦洗２遍.玻璃板干燥后,将０􀆰５mL亲和硅烷工作 液均匀涂在长玻璃板上,将０􀆰５m