ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 368—2026 鼻疽伯氏菌重组聚合酶恒温扩增（ RAA） 检测方法 RAA method for detection of Burkholderia mallei 2026 - 4 - 1发布 2026 - 4 - 1实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 368—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国兽医药品监察所 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 中国兽医药品监察所、北京市朝阳区农业农村综合服务中心 、百狮园动物保健科 技（广州）有限公司 。 本文件主要起草人： 王楠、徐磊、张柳青、艾青、朱小洁、刘军、辛凌翔、孙伟峰、李俊平、张晓 茜、张莹辉、张媛、彭小薇、胡君宜、程君生 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 368—2026 1 鼻疽伯氏菌重组聚合酶恒温扩增（ RAA）检测方法 1 范围 本文件规定了 鼻疽伯氏菌重组聚合酶恒温扩增（ RAA）检测方法的 技术要求 。 本文件适用于 疑似感染 鼻疽伯氏菌的马属动物 鼻分泌液、咳出液 和溃疡的脓液 及其血液 的核酸检 测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 668 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ddH 2O：双蒸水（ double -distilled water ） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） FAM： 6-羧基荧光素（ 6-carboxyfluorescein ） HP：假定蛋白基因 （hypothetical protein ） mM：毫摩尔每升（ millimolar） OD：光密度值（ optical density ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffered saline） RAA：重组聚合酶恒温扩增技术 （recombinase -aided amplification ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid） 5 试剂和材料 5.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格 要求。所 有试剂均用无 DNA /RNA酶污染的容器分装，所有 溶解和稀释用水 均用无核酸酶水 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 368—2026 2 5.2 引物及探针 ：配制 10 μM工作液，引物及探针序列参见附录 A，用于设计引物的鼻疽 伯氏菌 HP 基因参考序列见附录 B。 5.3 CTAB 提取缓冲液（ pH8.0）： 10 g/L CTAB ，0.7 mol/L NaCl ，0.05 mol/L Tris -HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。 5.4 DNA/RNA 抽提液：酚 :氯仿 :异戊醇（ 25:24:1）。 5.5 异丙醇。 5.6 70 %乙醇。 5.7 75 % 乙醇。 5.8 TE缓冲液（ pH 8.0）： 10 mmol/L Tris -HCl（pH 8.0）， 1 mmol/L EDTA （pH 8.0）。 5.9 PBS缓冲液（ pH7.4）： 8 g NaCl，0.2 g KCl ，1.42 g Na 2HPO 4，0.27 g KH 2PO 4，定容至 1L。 5.10 启动剂： 15 %聚乙二醇， 280 mM 乙酸镁。 5.11 RAA荧光反应单元：包含重组酶、单链结合蛋白、 DNA聚合酶的冻干粉。 5.12 阳性对照 ：制备方法参见附录 C。 5.13 阴性对照： pUC57 空载体质粒或者无 DNA /RNA酶水。 6 仪器设备 6.1 恒温荧光检测仪或荧光 定量 PCR仪。 6.2 微量移液器： 量程 0.5 μL ~ 2.5 μL、10 μL ~ 100 μL、20 μL ~ 200 μL。 6.3 超微量核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 涡旋振荡器 。 6.5 4 ℃高速冷冻离心机（ 8000 g以上）。 6.6 高压灭菌设备。 6.7 冰箱： 2 ℃ ~ 8 ℃和-20 ℃。 6.8 生物安全柜。 7 实验步骤 7.1 总则 马鼻疽是人兽共患病 ，鼻疽伯氏菌属于高致病性动物病原微生物。 样品处理 、核酸提取以及废弃物 处理按照 GB 19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物安全柜中进行，并做好个人防护 。采 集疑似样品必须采取严格生物安全防护措施，疑似样品采集和保存应符合 NY/T 541 的要求。 7.2 样本采集和处理 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 368—2026 3 7.2.1 鼻拭子 保定马匹，用 75% 酒精棉片擦拭清洁马匹鼻孔周围皮肤，无菌拭子插入鼻腔深部，轻轻擦拭并慢 慢旋转至少 3圈，将拭子置于 1 mL的PBS缓冲液样品保存管，折断拭子杆，保留拭子头，盖紧管盖， 4 ℃保存备用。 7.2.2 咳出液 用无菌吸管吸取咳出液至离心管，优先选取黏稠、带血丝或脓性的部分，体积约 1 mL ~ 2 mL。若 咳出液过于黏稠，加入等体积无菌 PBS 缓冲液，轻轻吹打混匀，降低黏度。 7.2.3 溃疡脓液 75 % 酒精清洁溃疡表面，脓液较多时，用无菌注射器抽取脓液 0.5mL~ 1 mL至离心管；脓液较少 时，用无菌拭子轻轻擦拭并慢慢旋转至少 3圈，将拭子置于 1 mL的PBS缓冲液样品保存管，折断拭子 杆，保留拭子头，盖紧管盖， 4 ℃保存备用。 7.2.4 血液 无菌注射器采集血液 5 mL~ 8 mL至抗凝管， 4 ℃保存备用。 7.2.5 样品处理 将含有鼻拭子、咳出液和溃疡脓液的保存管在涡旋振荡器上充分混匀， 4 ℃下3000 g离心 5 min， 取上清液，转移至 1.5 mL灭菌离心管中即用，血液样品无需处理。 7.3 样本 DNA提取 7.3.1 采用核酸提取使用 CTAB法提取，也可采用其他等效核酸提取方法。 7.3.2 将7.2.5处理后的样本上清液， 加入 600 µ L CTAB 提取缓冲液 （ pH 8.0） ， 涡旋振荡混匀后于 2 ℃ ~ 8 ℃孵育 15 min，期间颠倒离心管 2 ~ 3次。 12 000 r/min 离心 5 min，取上清液，加入 500 µ L DNA 抽 提液，上下颠倒离心管 2 ~ 3次，涡旋振荡混匀， 12 000 r/min离心 5 min，取上层水相，加入 0.7倍体 积异丙醇， 上下颠倒离心管 2 ~ 3次，4 ℃静置 30 min，4 ℃ 12000 r/min 离心 3 min， 小心弃去上清液 , 加 入700 µ L 70 %乙醇，重悬沉淀， 12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液。打开管盖，室温挥发液体， 加入 50 µ L ~ 100 µ L TE 缓冲液（ pH8.0）溶解核酸， -20℃保存。 7.3.3 将提取的核酸样品利用超微量核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计进行浓度测定， A260/A280比值 在1.7 ~ 2.0，DNA模板适宜用于 RAA检测。 7.4 检测程序 7.4.1 RAA反应体系 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用 n表示，按照 n+1分别配制反应液，充分混匀后分 装。 RAA反应体系的配置见附录 D中表 D.1。为避免反应提前启动， RAA反应体系配置时， 启动剂不 应与其他组分提前混匀， 宜分开滴加在管壁 或管盖上。 7.4.2 RAA反应程序 RAA反应程序见附录 D.2。将启动剂与体系充分混匀，放入恒温荧光检测仪，设置选定 FAM 作 为报告基团，选择 None作为淬灭基团，先进行预热，再启动扩增程序， 扩增程序结束后收集荧光信号。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 368—2026 4 8 结果判定 8.1 试验成立条件 阳性对照 有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T值≤ 15 min。阴性对照无荧 光对数增长，相应的无报告 T值。实验结果有效，否则应重新进行试验。 8.2 结果判定 被检样品 荧光对数增长 ，T值≤ 15 min，则判为 鼻疽伯氏菌 核酸阳性； 被检样品 无荧光对数增长，或无报告 T值，则判定为 鼻疽伯氏菌 核酸阴性；