SN-T 4708-2016 国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４７０８—２０１６国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳狏犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪犲犪狀犱狏犻犫狉犻狅犿犻犿犻犮狌狊犫狔犱狌狆犾犲狓狉犲犪犾  狋犻犿犲犘犆犚犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１６１２１２发布２０１７０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：韩辉、杨宇、吴海磊、谭克为、宋亚京、李海山、徐宝梁。 Ⅰ犛犖／犜４７０８—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌的检测方法，包括检测对象、样本采集和处理、操作方法及结果报告。本标准适用于国境口岸入出境人员、环境水体携带霍乱弧菌（包括Ｏ１群、Ｏ１３９群和非Ｏ１群／Ｏ１３９群霍乱弧菌）和拟态弧菌的分子生物学检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９ —２００８　实验室　生物安全通用要求ＷＳ２３３—２００２　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部令第４５号）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１霍乱弧菌　犞犻犫狉犻狅犆犺狅犾犲狉犪犲弧菌属，革兰氏染色阴性。病人和带菌者是霍乱的主要传染源，病人及带菌者的粪便或排泄物污染水源或食物后可引起霍乱暴发流行。霍乱有耐热的Ｏ抗原和不耐热的Ｈ抗原。根据Ｏ抗原不同，霍乱弧菌可分为２００多个血清型，其中仅Ｏ１群和Ｏ１３９群霍乱弧菌产毒株可引起霍乱的流行。３．２拟态弧菌　犞犻犫狉犻狅犕犻犿犻犮狌狊弧菌属，革兰氏染色阴性。广泛存在于自然界河水、海水和海产品中。是一种人和水产动物共患病病原菌，可以通过水体和水产品感染人类，已经成为某些地区散发性和流行性腹泻及食物中毒的病原菌之一。拟态弧菌生化特性与霍乱弧菌极为相似，主要是引起人类急性腹泻。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＣＲ：聚合酶链式反应ＤＮＡ：脱氧核糖核酸ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酪ＦＡＭ：６ 羧基荧光素，一种荧光报告基团ＨＥＸ：六氯 ６ 甲基荧光素，一种荧光报告基团１犛犖／犜４７０８—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ＢＨＱ：黑洞淬灭基团５　检测对象５．１　疑似感染霍乱弧菌和拟态弧菌的入出境人员的生物样本，如粪便、呕吐物等。５．２　疑似污染霍乱弧菌和拟态弧菌的环境样本，如入境船舶压舱水等。６　生物安全要求６．１　检测工作中的个人防护应按照ＧＢ１９４８９ —２００８的要求进行个人防护。６．２　实验室应遵循ＧＢ１９４８９ —２００８和ＷＳ２３３—２００２对生物安全２级（ＢＳＬ  ２）实验室的生物安全要求。６．３　使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９ —２００８对废弃物的处理要求进行无害化处理。６．４　样本运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定。７　仪器和设备７．１　荧光定量ＰＣＲ仪。７．２　生物安全柜。７．３　普通冰箱。７．４　７０℃及以下超低温冰箱。７．５　普通台式离心机。７．６　高速冷冻离心机（转速可达２００００× 犵）。７．７　涡旋器。７．８　微量可调移液器（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）及配套带滤芯吸头。８　试剂８．１　生理盐水：蒸馏水和ＮａＣｌ配制浓度为０．９％的生理盐水。８．２　核酸提取试剂：细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ公司）１）。８．３　核酸抽提液（含０．９％ＮａＣｌ和０．１％ＥＤＴＡ  Ｎａ２的混合液）。８．４　实时荧光ＰＣＲ试剂：用ＴａＫａＲａ公司的ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ２）。１）　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。２）　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。８．５　ＤＥＰＣ水。８．６　实时荧光ＰＣＲ引物及探针，如下： — — —霍乱弧菌检测引物和探针：上游引物ＦｏｍｐＷ：５’ ＴＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧ  ３ ’下游引物ＲｏｍｐＷ：５’ ＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＧＧＴＴＧＣＣＧＴＴＧ  ３ ’探针ＰｏｍｐＷ：５’ ＦＡＭ  ＴＧＣＴＣＡＡＴＧＡＴＡＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣ  ＢＨＱ１  ３ ’ ２犛犖／犜４７０８—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.— — —拟态弧菌检测引物和探针：上游引物Ｆｖｍｈ：５’ ＧＧＴＡＴＧＴＧＴＴＡＡＧＧＣＧＴＡＧＴＴＣＴＧ  ３ ’下游引物Ｒｖｍｈ：５’ ＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＡＣＣＣ  ３ ’探针Ｐｖｍｈ：５’ ＨＥＸ  ＣＴＴＣＴＣＧＴＧＧＧＴＴＡＣＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴ  ＢＨＱ１  ３ ’ ９　检测程序９．１　样本的采集、运输及保存９．１．１　粪便样本采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集１ｇ～５ｇ，水样便采集１ｍＬ～３ｍＬ。亦可用已湿润的直肠棉拭插入直肠内３ｃｍ～５ｃｍ处并轻轻旋转，将有可见粪便的棉拭放入采便管内。采便管用耐低温油性记号笔记上编号，立即置于冷藏箱内，送到实验室，立即对粪便样本进行核酸提取。如不能在２ｈ内检测应插入Ｃａｒｙ Ｂｌａｉｒ运送培养基运送。９．１．２　呕吐物样本用无菌压舌板或棉拭子挑取少量呕吐物作为检材，放入灭菌塑料管、自封塑料袋或灭菌带盖瓶中，密封后用耐低温油性记号笔记上编号，立即置于冷藏箱内，送到实验室。９．１．３　水样样本以灭菌的５００ｍＬ盐水瓶采集水样４５０ｍＬ，密闭后用耐低温油性记号笔记上编号，尽快运送到实验室。如不能在一天内送检者，应在采水点即将浓缩蛋白胨水加至水样中，即将１０倍浓缩碱性蛋白胨水５０ｍＬ加入４５０ｍＬ水样中，摇匀，室温运送至实验室。９．２　样本的前处理９．２．１　粪便样本挑取米粒大小粪便或１ｍＬ水样便，放置于有０．５ｍＬ生理盐水的离心管中，振荡混匀，１３０００× 犵离心２ｍｉｎ。去尽上清，沉淀用于核酸提取。９．２．２　呕吐物样本挑取指甲大小呕吐物，放置于有０．５ｍＬ生理盐水的离心管中，振荡混匀，１３０００× 犵离心２ｍｉｎ。去尽上清，沉淀用于核酸提取。９．２．３　水样本将采集的４５０ｍＬ水样本，将１０倍浓缩碱性蛋白胨水加入５０ｍＬ于３７℃培养６ｈ～８ｈ，１３０００× 犵离心２ｍｉｎ。去尽上清，沉淀用于核酸提取。９．３　样本的核酸提取将采集的粪便样本、呕吐物样本可直接应用ＱＩＡＧＥＮ公司的成品试剂盒，依据说明书提取样本核酸，可直接用于荧光ＰＣＲ反应。将采集的４５０ｍＬ水样本，加入５０ｍＬ十倍浓缩碱性蛋白胨水于３７℃培养６ｈ～８ｈ，１３０００× 犵离心２ｍｉｎ。去尽上清，沉淀用ＱＩＡＧＥＮ公司的成品试剂盒，依据说明书提取样本核酸，可直接用于荧光ＰＣＲ反应。３犛犖／犜４７０８—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.注：本标准推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同ＤＮＡ提取试剂盒。９．４　荧光犘犆犚检测９．４．１　霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚反应体系霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光ＰＣＲ反应体系，按表１顺序依次加入。表１　霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚反应体系（以２０μ犔体系为例）名称浓度加样量模板Ｄ