SN-T 4097-2015 贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４０９７—２０１５贝类派琴虫实时荧光犘犆犚检测方法犚犲犪犾  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犘犆犚狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犘犲狉犽犻狀狊狌狊狊狆．犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺２０１５０２０９发布２０１５０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张雪、肇慧君、李叶、李振荣、贾 /G21。 Ⅰ犛犖／犜４０９７—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.贝类派琴虫实时荧光犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光ＰＣＲ检测方法。本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１实时荧光犘犆犚　狉犲犪犾  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犘犆犚在普通聚合酶链反应的基础上加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，犜犪狇酶的５ ′  ３ ′外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步，达到实时定量的目的。３．２犆狋值　犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，也可称为Ｃｐ值。４　试剂和材料４．１　１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、ＳＤＳ（１０％）。溶液配制见附录Ａ。４．２　蛋白酶Ｋ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）。４．３　Ｔｒｉｓ 饱和酚。４．４　三氯甲烷。４．５　异戊醇。４．６　无水乙醇。４．７　生理盐水。４．８　１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２、２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、５Ｕ／μＬ犜犪狇酶。４．９　１０μｍｏｌ／Ｌ上游引物、１０μｍｏｌ／Ｌ下游引物、１０μｍｏｌ／Ｌ探针。４．１０　ＴＥ缓冲液（ｐＨ８．０）。１犛犖／犜４０９７—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５　仪器和设备５．１　组织研磨器。５．２　电子天平。５．３　冷冻离心机。５．４　涡旋振荡器。５．５　水浴锅。５．６　超纯水机。５．７　冰箱（２℃～８℃、－２０℃、－８０℃）。５．８　高压灭菌锅。５．９　实时荧光ＰＣＲ仪。６　检测步骤６．１　取样选取濒死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制，生长迟缓等）。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织２５ｍｇ，置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻５ｍｉｎ，放至室温，再置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水５０μＬ，进行手工匀浆研磨。６．２　犇犖犃提取和纯化６．２．１　将匀浆液倒入１．５ｍＬ离心管中，加入生理盐水补充体积至２００μＬ，加２０μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ），再加ＳＤＳ至终浓度为１％，上下颠倒混匀。６．２．２　混合液置于５５℃水浴锅内水浴２．５ｈ。６．２．３　向匀浆液中按１∶１比例加入苯酚 ∶三氯甲烷 ∶异戊醇混合液（Ａ．５），上下颠倒混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。６．２．４　转移上层水相，加入等体积三氯甲烷 ∶异戊醇混合液（Ａ．６），上下颠倒混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。６．２．５　转移上层水相，加入两倍体积的无水乙醇，－２０℃放置３０ｍｉｎ或过夜。６．２．６　１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，沉淀ＤＮＡ，倾去上清液。６．２．７　于沉淀中加入７５％乙醇溶液５００μＬ，轻轻混匀后１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，倾去上清液，室温晾干。６．２．８　用２０μＬＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ沉淀，－２０℃保存备用。组织ＤＮＡ提取也可采用等效的商品化ＤＮＡ提取试剂盒，按照说明书进行操作。６．３　实时荧光犘犆犚检测６．３．１　实时荧光犘犆犚引物该引物扩增派琴虫核糖体ＤＮＡ序列中的ＩＴＳ区域基因序列，扩增片度长度为６９ｂｐ，参见附录Ｂ。上游引物：５ ′  ＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡ  ３ ′下游引物：５ ′  ＣＴＴＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣ  ３ ′Ｔａｑｍａｎ探针：５ ′  ＦＡＭ  ＣＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＧＡＧ  ＥＣＬＩＰＳＥ  ３ ′ ２犛犖／犜４０９７—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.引物与探针合成后配制成１００μｍｏｌ／Ｌ储备液，－２０℃保存备用。使用前均采用灭菌蒸馏水稀释为１０μｍｏｌ／Ｌ加入体系。６．３．２　实时荧光犘犆犚反应体系见表１。表１　反应体系试剂体积／μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液（不含ＭｇＣｌ２）２．５ＭｇＣｌ２溶液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４ｄＮＴＰ溶液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．５上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５探针（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５犜犪狇酶（５Ｕ／μＬ）０．５ＤＮＡ模板１０灭菌蒸馏水至总体积２５６．３．３　实时荧光犘犆犚反应参数ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性１０ｓ，５７℃退火３０ｓ，共４０个循环，每个循环结束后采集ＦＡＭ通道数据。６．４　结果判定６．４．１　试验成立判定试验结束后读取Ｃｔ值。反应结果应同时符合以下条件，否则试验结果无效：ａ）　阴性对照无Ｃｔ值并且无扩增曲线；ｂ）　空白对照无Ｃｔ值并且无扩增曲线；ｃ）　阳性对照Ｃｔ值小于或等于３５并且有明显扩增曲线。６．４．２　试验结果报告试验结果报告如下：ａ）　检测样品的Ｃｔ值大于或等于４０时，判定为派琴虫阴性。ｂ）检测样品的Ｃｔ值小于或等于３５时，判定为派琴虫阳性。ｃ）检测样品的Ｃｔ值大于３５而小于４０时，判定为可疑。此时可对样品重复进行荧光ＰＣＲ检测，如果样品重复检测的Ｃｔ值大于或等于４０，则判定为派琴虫阴性；如果样品重复检测的Ｃｔ值小于４０，并且有明显扩增曲线，则判定为派琴虫阳性。３犛犖／犜４０９７—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）相关溶液配制犃．１　１犿狅犾／犔犜狉犻狊·犎犆犾溶液（狆犎８．０）称取１２１．１ｇ三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）溶解于８００ｍＬ水中，用浓盐酸调ｐＨ至８．０，加水定容至１Ｌ。在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）条件下灭菌２０ｍｉｎ。犃．２　１０％犛犇犛在９００ｍＬ水中溶解１００ｇ电泳级ＳＤＳ，加热至６８℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的ｐＨ至７．２，加水定容至１Ｌ，分装备用。犃．３　０．５犿狅犾／犔犈犇犜犃溶液称取１８６．１ｇ二水乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ  Ｎａ２·２Ｈ２Ｏ）加入７００ｍＬ水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用１０ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液调ｐＨ至８．０，用水定容到１Ｌ，分装后高压灭菌。犃．４　犜犈缓冲液（狆犎８．０）在８００ｍＬ水中依次加入１０ｍＬ的１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ（ｐＨ８．０）和２ｍＬ的５００ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），加水定容至１０００ｍＬ，在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）条件下灭菌２０ｍ