书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ０ ５ ６—２ ０ １ ４ 蜂蜜中烟曲霉素残留量的测定液相色谱 串联质谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犳 狌 犿 犪 犵犻 犾 犾 犻 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 犻 狀犺 狅 狀 犲 狔—犔 犆  犕 犛  犕 犛  犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ４１ １１ ９发布 ２ ０ １ ５０ ５０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：刘晓茂、葛娜、李学民、王飞、张进杰、曹彦忠、宋强。 Ⅰ犛 犖／犜４ ０ ５ ６—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.蜂蜜中烟曲霉素残留量的测定液相色谱 串联质谱法 １　范围 本标准规定了蜂蜜中烟曲霉素残留量的液相色谱 串联质谱测定方法 。本标准适用于蜂蜜中烟曲霉素残留量的测定 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　方法提要 蜂蜜试样用水稀释 ，经ＨＬ Ｂ固相萃取柱净化 ，液相色谱 串联质谱 （Ｅ Ｓ Ｉ ＋）检测，外标法定量 。 ４　试剂和材料 除另有说明外 ，所用试剂均为优级纯 ，水为Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．１　甲醇：色谱纯。 ４．２　乙腈：色谱纯。 ４．３　甲酸：优级纯。 ４．４　乙酸乙酯 ：色谱纯。 ４．５　甲醇水（３＋７，体积比）溶液：取３ ０ｍＬ甲醇（４． １）用水定容至 １ ０ ０ｍＬ 。 ４．６　乙腈水（１＋１，体积比）溶液：取５ ０ｍＬ乙腈（４． ２）用水定容至 １ ０ ０ｍＬ 。 ４．７　标准物质 ：烟曲霉素 （ＣＡ Ｓ号：２ ３ １ １ ０  １ ５  ８ ） ；纯度大于或等于 ９ ８％。 ４．８　烟曲霉素标准贮备溶液 ：１． ０ｍｇ／ｍＬ。称取适量的烟曲霉素标准物质 （４． ７） ，用甲醇溶解并配制成 １． ０ｍｇ／ｍＬ的标准贮备液 。避光保存于 －１ ８℃冰柜中。 ４．９　烟曲霉素标准工作溶液 ：１． ０μｇ／ｍＬ。吸取适量烟曲霉素标准贮备溶液 （４． ８） ，用乙腈水（４． ６）稀释成１． ０μｇ／ｍＬ的标准工作溶液 ，避光保存于 －１ ８℃冰柜中。 ４．１ ０　ＨＬ Ｂ固相萃取柱 ：５ ０ ０ｍｇ，６ｍＬ，或相当者 ，使用前依次用 ５ｍＬ甲醇和１ ０ｍＬ水预处理 ，保持柱体湿润。 ４．１ １　微孔滤膜 ：０． ２μｍ，尼龙。 ５　仪器 ５．１　液相色谱 串联四极杆质谱仪 ，配有电喷雾离子源 （Ｅ Ｓ Ｉ） 。 １犛 犖／犜４ ０ ５ ６—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.５．２　分析天平 ：感量分别为 ０． ０ １ｍｇ和０． ０ １ｇ。 ５．３　旋涡混匀器 。 ５．４　固相萃取装置 。 ５．５　真空泵：真空度应达到 ８ ０ｋ Ｐ ａ。 ５．６　氮气吹干仪 。 ５．７　三角瓶：２ ０ ０ｍＬ 。 ５．８　试管：１ ０ｍＬ。 ６　试样的制备与保存 ６．１　试样的制备 对于无结晶的实验室样品 ，将其搅拌均匀 。对有结晶的样品 ，在密闭情况下 ，置于不超过 ５ ０℃的水浴中振荡 ，待样品全部融化后搅拌均匀 ，冷却至室温 。分出０． ５ｋｇ作为试样 。 ６．２　试样保存 试样置于常温下 ，避光保存 。试样在制备和保存过程中应避免受到污染或待测物含量发生变化 。 ７　测定步骤 ７．１　提取净化 称取蜂蜜样品 ５ｇ（精确到０． ０ １ｇ） ，置于２ ０ ０ｍＬ 三角瓶（５． ７）中，加入１ ５ｍＬ水，涡旋混合 ５ｍ ｉ ｎ后，全部倒入下接固相萃取柱 （４． １ ０）的贮液器中 ，在固相萃取装置 （５． ４）上使样液以小于 ２ｍＬ／ｍ ｉ ｎ的流速依次通过固相萃取柱 ，待样液全部通过后 ，用２ ５ｍＬ甲醇水（４． ５）洗涤固相萃取柱 ，弃去全部流出液 。在６ ５ｋ Ｐ ａ的负压下 ，减压抽干 １ ０ｍ ｉ ｎ。用７ｍＬ乙酸乙酯 （４． ４）洗脱至１ ０ｍＬ试管（５． ８）中，于４ ０℃水浴中氮气吹至近干 ，用１ｍＬ乙脂＋水（４． ６）溶解残余物 ，供液相色谱 串联质谱仪测定 。 ７．２　测定 ７．２．１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 ： ａ）　色谱柱：Ｃ１ ８，１． ７μｍ，５ ０ｍｍ×２． １ｍｍ （内径）或相当者 ； ｂ）　柱温：３ ５℃； ｃ）　进样量：１ ０μＬ； ｄ）　流动相：Ａ：０． １％甲酸（４． ３）水溶液；Ｂ：乙腈。梯度洗脱条件见表 １。 表１　液相色谱梯度洗脱条件 时间／ｍ ｉ ｎ 流速／（μＬ／ｍ ｉ ｎ） 流动相Ａ／％ 流动相Ｂ／％ ０ ３ ０ ０ ８ ５ １ ５ ０． ７ ３ ０ ０ １ ０ ９ ０ ２ ３ ０ ０ １ ０ ９ ０ ２． １ ３ ０ ０ ８ ５ １ ５ ４ ３ ０ ０ ８ ５ １ ５ ２犛 犖／犜４ ０ ５ ６—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７．２．２　质谱参考条件 质谱参考条件如下 ： ａ）　离子源：电喷雾离子源 ； ｂ）　扫描方式 ：正离子扫描 ； ｃ）　检测方式 ：多反应监测 （ＭＲＭ） ； ｄ）　雾化气、气帘气、辅助加热气 、碰撞气均为高纯氮气 ；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求 ，参考条件参见附录 Ａ； ｅ）　喷雾电压 、去集簇电压 、碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度 ，参考条件参见附录 Ａ。 ７．２．３　液相色谱 串联质谱测定 ７．２．３．１　定性确证 被测组分选择 １个母离子 ，２个以上子离子 ，在相同实验条件下 ，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在 ±２． ５％之内；且样品谱图中被测组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较 ，偏差不超过表 ２规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物 。 表２　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 犓／％ 犓＞５ ０ ２ ０ ＜犓＜５ ０ １ ０ ＜犓＜２ ０ 犓≤１ ０ 允许的最大偏差 ／％ ±２ ０ ±２ ５ ±３ ０ ±５ ０ ７．２．３．２　定量测定 外标法定量 ：在仪器最佳工作条件下 ，烟曲霉素的混合基质标准校准溶液进样测定 ，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标 ，以峰面积为纵坐标 ，绘制标准工作曲线 ，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。烟曲霉素的标准物质多反应监测 （ＭＲＭ）色谱图参见图 Ｂ． １。 ７．３　空白实验 除不称取试样外 ，均按上述步骤进行 。 ７．４　结果计算与表述 按式（１）计算试样中烟曲霉素的含量 ： 犡＝（犃－犃０）×犮×犞×１０ ０ ０犃Ｓ×犿×１０ ０ ０…………………………（ １） 　　式中： 犡— — —试样中烟曲霉素的含量 ，单位为微克每千克 （μｇ／ｋｇ） ； 犃— — —样液中烟曲霉素的峰面积 ； 犃０— — —空白实验中烟曲霉素的峰面积 ； 犮— — —标准工作溶液中烟曲霉素的浓度 ，单位为纳克每毫升 （ｎｇ／ｍＬ） ； 犞— — —样液最终定容体积 ，单位为毫升 （ｍＬ） ； 犃Ｓ— — —标准工作溶液中烟曲霉素的峰面积 ； ３犛 犖／犜４ ０ ５ ６—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.犿— — —最终样液所代表的试样量 ，单位为克 （ｇ） 。 ８　测定低限 、回收率 ８．１　测定低限 本方法测定低限 ：本标准方法的测定低限为 ５． ０μｇ／ｋｇ。 ８．２　回收率 蜂蜜中烟曲霉素添加浓度及平均回收率的实验数据如下 ： ａ）　在添加量为 ５． ０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为 ７ ９． ３％； ｂ）　在添加量为 １ ０． ０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为 ８ １． ２％； ｃ）　在添加量为 ２ ０． ０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为 ８ ３． ４％； ｄ）　在添加量为 ５ ０． ０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为 ８ ５． ３％。 ４犛 犖／犜４ ０ ５ ６—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃（资料性附录 ） 参考质谱条件 １） 参考质谱条件 ： ａ）　离子源：电喷雾离子源 ； ｂ）扫描方式 ：正离子扫描 ； ｃ）检测方式 ：多反应监测 （ＭＲＭ） ； ｄ）电喷雾电压 ：５４ ０ ０Ｖ ； ｅ）气帘气压力流速 ：３． ５Ｌ／ｍ ｉ ｎ； ｆ）雾化气压力流速 ：６Ｌ／ｍ ｉ ｎ； ｇ）辅助气压力流速 ：８Ｌ／ｍ ｉ ｎ； ｈ）辅助气温度 ：５ ５ ０℃； ｉ）去簇电压 ：９ ０Ｖ； ｊ）驻留时间 ：１ ０ ０ｍ ｓ； ｋ）定性离子对 ：４ ５ ９／１ ３ １（犿／狕）和４ ５ ９／２ ３ ３（犿／狕） ，其中４ ５ ９／２ ３ ３（犿／狕）碰撞能量 ：１ ７Ｖ； ｌ）定量离子对 ：４ ５ ９／１ ３ １（犿／狕） ，碰撞能量 ：３ ８Ｖ。 １）　非