SN-T 4043-2014 蚊类携带丝虫班氏丝虫马来丝虫的PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４０４３—２０１４蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫）的犘犆犚检测方法犘犆犚犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狀犵犠狌犮犺犲狉犲狉犻犪犫犪狀犮狉狅犳狋犻犪狀犱犅狉狌犵犻犪犿犪犾犪狔犻犻狀犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊２０１４１１１９发布２０１５０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：田虹、刘丽娟、刘芳、高玉峰、陈肖潇、张红兵。 Ⅰ犛犖／犜４０４３—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫）的犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的ＰＣＲ检测方法，包括样本检测程序、检测方法、结果判定及报告。本标准适用于检验检疫机构对蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则ＳＮ／Ｔ１３００　国境口岸蚊类监测规程ＳＮ／Ｔ１５５３　入出境航空器医学媒介生物监测规程ＳＮ／Ｔ１５６０　入出境船舶医学媒介生物监测规程ＳＮ／Ｔ１５９６　入出境车辆医学媒介生物监测规程ＳＮ／Ｔ１８７６　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１丝虫　犉犻犾犪狉犻犪是由吸血节肢动物传播的一类寄生性线虫。成虫寄生在脊椎动物终宿主的淋巴系统、皮下组织、腹腔、胸腔等处。幼虫在某些吸血节肢动物中间宿主体内进行发育。当这些中间宿主吸血时，成熟的感染期幼虫即自其喙逸出，经皮肤侵入终宿主体内发育为成虫。寄生于人体的丝虫主要有８种，我国流行的主要以班氏丝虫（犠狌犮犺犲狉犲狉犻犪犫犪狀犮狉狅犳狋犻）和马来丝虫（犅狉狌犵犻犪犿犪犾犪狔犻）为主。二者形态相似，虫体皆为乳白色丝状，体表光滑，雌、雄异体。３．２蚊类　犕狅狊狇狌犻狋狅班氏丝虫的主要传播媒介为淡色库蚊（犆狌犾犲狓狆犻狆犻犲狀狊狆犪犾犾犲狀狊）和致倦库蚊（犆狓．狆犻狆犻犲狀狊狇狌犻狀狇狌犲  犳犪狊犮犻犪狋狌狊），马来丝虫病的主要媒介为中华按蚊（犃狀狅狆犺犲犾犲狊狊犻狀犲狀狊犻狊）和嗜人按蚊（犃狀．犪狀狋犺狉狅狆狅狆犺犪犵狌狊）等。３．３犘犆犚技术　狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀ＰＣＲ技术是体外酶促合成特异ＤＮＡ片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的ＤＮＡ得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等１犛犖／犜４０４３—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.特点。本文件中采用ＰＣＲ技术，参考ＫｉｒｔｉＭｉｓｈｒａ等的文献（Ｃｏｍｂｉｎｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ犅狉狌犵犻犪犿犪犾犪狔犻ａｎｄ犠狌犮犺犲狉犲狉犻犪犫犪狀犮狉狅犳狋犻ｕｓｉｎｇｓｉｎｇｌｅＰＣＲ），分别合成马来丝虫和班氏丝虫的特异引物Ｈｈａ１和ＳｓｐＩ，扩增目标ＤＮＡ片段为３２２ｂｐ和１８８ｂｐ的方法。４　缩略语下列缩略语适合于本文件。ｄＮＴＰ：脱氧核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＰＣＲ：聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）ＳＤＳ：十二烷基磺酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒｓｅ）５　检测对象出入境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫，主要以淡色库蚊（犆狌犾犲狓狆犻狆犻犲狀狊狆犪犾犾犲狀狊）、致倦库蚊（犆狓．狆犻狆犻犲狀狊狇狌犻狀狇狌犲犳犪狊犮犻犪狋狌狊）、中华按蚊（犃狀狅狆犺犲犾犲狊狊犻狀犲狀狊犻狊）及嗜人按蚊（犃狀．犪狀 狋犺狉狅狆狅狆犺犪犵狌狊）为主。６　生物安全要求实验过程中生物安全要求如下： — — —检测工作中的个人防护参照ＧＢ１９４８９； — — —实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全２级（ＢＳＬ  ２）实验室的生物安全要求； — — —使用过的实验用品应遵循ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理。７　主要试剂主要试剂如下： — — —样本处理液：在新鲜配制的９７ｍＬＭＥＭ中加入５６℃热灭活３０ｍｉｎ的胎牛血清２ｍＬ、１ｍＬ的青链霉素（青霉素Ｇ１００００Ｕ／ｍＬ、链霉素１００００μｇ／ｍＬ），用７．５％碳酸氢钠溶液调至ｐＨ７．２； — — —Ｈａｎｋ ′ ｓ液：配方见附录Ａ； — — —基因组ＤＮＡ提取试剂：用ＴＩＡＮａｍｐ基因组ＤＮＡ提取试剂盒１），详见说明书，内含ＧＡ、ＧＢ、ＧＤ、ＰＷ、ＴＥ、蛋白酶Ｋ、吸附柱ＣＢ３等；１）　ＤＮＡ提取试剂盒是由天根生化科技（北京）有限公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。— — —ｄｄＨ２Ｏ； — — —马来丝虫的ＰＣＲ扩增引物（目标片段为３２２ｂｐ）：ＨｈａｌＦ：５’ ＧＣＧＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣ  ３ ’ ；ＨｈａｌＲ：５’ ＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＧＣ  ３ ’ ； — — —班氏丝虫的ＰＣＲ扩增引物（目标片段为１８８ｂｐ）：２犛犖／犜４０４３—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ＳｓｐＩＦ：５’ ＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＡＧＴＡＧＣＧ  ３ ’ ＳｓｐＩＲ：５’ ＣＣＣＴＣＡＣＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＣ  ３ ’ 。８　样本的采集与处理８．１　样本的采集根据监测任务等实际工作需要采集所需数量的蚊虫样本，样本的采集样品的采集参照ＳＮ／Ｔ１３００、ＳＮ／Ｔ１５５３、ＳＮ／Ｔ１５６０、ＳＮ／Ｔ１５９６、ＳＮ／Ｔ１８７６执行。８．２　样本的处理８．２．１　样本分拣、分装将捕获的蚊虫置于－２０℃，３０ｍｉｎ冷冻处死后进行分拣。若条件允许，分拣过程应在简易低温装置上进行。分拣后按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平皿等），加贴标签，放入液氮或干冰内（－７０℃以下）运输或保存。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。８．２．２　样本的处理样本处理过程应在冰上进行。取出低温保存样本，置于研磨器中，加入Ｈａｎｋ’ｓ液１ｍＬ吹洗，弃去液体后加入１ｍＬ样本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，将研磨液吸入１．５ｍＬ离心管中，平衡后置预冷４℃的离心机上，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。取上清液用于基因组ＤＮＡ提取。剩余的样本研磨液置于－７０℃以下冰箱内以备复查。９　检验程序９．１　基因组犇犖犃提取９．１．１　吸取蚊样本研磨液上清２００μＬ置于１．５ｍＬ离心管中，加入２０μＬ蛋白酶Ｋ溶液，混匀。９．１．２　加入２００μＬ缓冲液ＧＢ，充分颠倒混匀，７０℃放置１０ｍｉｎ，简短离心除去管盖内壁的水珠。９．１．３　加入２００μＬ无水乙醇，充分振荡混匀１５ｓ，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心除去管盖内壁残留液体。９．１．４　将上一步所得溶液和絮状沉淀均加入到吸附柱ＣＢ３中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，弃滤液。９．１．５

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