SN-T 4009-2014 国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法

书书书　　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４００９—２０１４国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犃狀犪狆犾犪狊犿犪狆犺犪犵狅犮狔狋狅狆犺犻犾狌犿犫狔犘犆犚犻狀狋犻犮犽狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１４１１１９发布２０１５０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高玉峰、赵亮、邓华、陈肖潇、程晓兰、姜陆、宋锋林。 Ⅰ犛犖／犜４００９—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象、生物安全要求、样品采集及保存运输、检测方法和结果判断。本标准适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１２９３　国境口岸蜱类监测规程ＳＮ／Ｔ１４３２　入出境列车医学媒介生物监测规程ＳＮ／Ｔ１５５３　入出境航空器医学媒介生物监测规程ＳＮ／Ｔ１５６０　入出境船舶医学媒介生物监测规程ＳＮ／Ｔ１５９６　入出境车辆医学媒介生物监测规程ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１蜱　狋犻犮犽属蜱螨亚纲的寄螨目（Ｐａｒａｓｉｔｉｆｏｒｍｅｓ）、蜱总科（Ｉｘｏｄｉｄｅａ）。成虫在躯体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱（ｈａｒｄｔｉｃｋ），属硬蜱科（Ｉｘｏｄｉｄａｅ）；背面无盾板者，统称为软蜱（ｓｏｆｔｔｉｃｋ），属软蜱科（Ａｒｇａｓｉ ｄａｅ）。３．２嗜吞噬细胞无形体　犃狀犪狆犾犪狊犿犪狆犺犪犵狅犮狔狋狅狆犺犻犾狌犿嗜吞噬细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，属立克次体目、无形体科，主要通过硬蜱叮咬传播，可引起人粒细胞无形体病。４　检测对象本标准检测对象包括：— — —出入境交通工具、集装箱、货物、行李等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱；— — —口岸地区采集的游离蜱或从口岸地区宿主体表采集的寄生蜱。１犛犖／犜４００９—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５　生物安全要求实验过程中生物安全要求如下： — — —检测工作中的个人防护参照ＧＢ１９４８９； — — —实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全２级（ＢＳＬ  ２）实验室的生物安全要求； — — —使用过的实验用品应遵循ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理。６　器材与试剂６．１　器材本标准使用的主要仪器设备如下： — — —高速冷冻离心机； — — —高压蒸汽灭菌锅； — — —ＰＣＲ仪； — — —生物安全柜； — — —电泳仪； — — —凝胶成像系统； — — —匀浆器等。６．２　试剂本标准使用的主要试剂如下： — — —引物：外引物ＯＵＴ  １及ＯＵＴ  ２、内引物ＩＮ  １及ＩＮ  ２； — — —１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）； — — —ｄＮＴＰｓ； — — —ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ； — — —琼脂糖； — — —染色剂ＧｅｌＲｅｄ； — — —ｄｄＨ２Ｏ； — — —基因组ＤＮＡ提取试剂盒等。７　蜱类的采集及保存运输７．１　采集蜱类采集参照下列标准执行：ＳＮ／Ｔ１２９３、ＳＮ／Ｔ１４３２、ＳＮ／Ｔ１５５３、ＳＮ／Ｔ１５６０、ＳＮ／Ｔ１５９６。７．２　分装将采集的蜱类现场分拣，按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平皿等），加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点（生境）、采集人、宿主等。７．３　保存运输分装完毕的蜱类样品，装入适当的冷冻、冷藏或常温装置，送实验室进行分类鉴定和嗜吞噬细胞无形体检测。２犛犖／犜４００９—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８　样品的检测８．１　基因组犇犖犃提取使用试剂盒ＴａＫａＲａＭｉｎｉＢＥＳＴＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ１）进行基因组ＤＮＡ提取，也可使用达同等效果的基因组ＤＮＡ提取试剂盒，提取方法按照附录Ａ或按相应试剂盒说明书进行。１）　ＤＮＡ提取试剂盒是由ＴａＫａＲａ公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。２）　染色剂ＧｅｌＲｅｄ是由美国Ｂｉｏｔｉｕｍ公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。８．２　核酸检测（犘犆犚法）８．２．１　引物设计根据嗜吞噬细胞无形体１６ＳｒＲＮＡ序列，设计并合成套式ＰＣＲ的内、外引物。外引物ＯＵＴ  １和ＯＵＴ  ２扩增的核酸片段长度为６５３ｂｐ；内引物ＩＮ  １和ＩＮ  ２扩增的核酸片段长度为３８９ｂｐ。引物序列如下：ＯＵＴ  １：５’ ＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＣＧ  ３ ’ ＯＵＴ  ２：５’ ＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＣ  ３ ’ ＩＮ  １：５’ ＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＴＴＧ  ３ ’ ＩＮ  ２：５’ ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＴＡＣ  ３ ’引物合成后用ｄｄＨ２Ｏ溶解并分装冻存于－２０℃冰箱内。４条引物溶解后浓度均为２０μｍｏｌ／Ｌ。８．２．２　犘犆犚８．２．２．１　对照的设立在核酸扩增实验中同时按下列所述设阳性对照、阴性对照和空白对照：— — —阳性对照：以构建的嗜吞噬细胞无形体质粒ＤＮＡ（ｐＭＤ２０  Ｔ  ＯＵＴ）作为阳性对照扩增模板；— — —阴性对照：以实验室养殖、未感染病原体的蜱类基因组ＤＮＡ作为阴性对照扩增模板；— — —空白对照：以ｄｄＨ２Ｏ作为空白对照扩增模板。８．２．２．２　犘犆犚第一轮反应ＰＣＲ反应总体积２５μＬ。包括ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１Ｕ／μＬ）０．６μＬ、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５ μＬ、ｄＮＴＰｓ２．０μＬ、模板ＤＮＡ３．０ μＬ、外引物ＯＵＴ  １（２０μｍｏｌ／Ｌ）及ＯＵＴ  ２（２０μｍｏｌ／Ｌ）各１．０μＬ，补充ｄｄＨ２Ｏ使总体积达到２５μＬ。反应条件为：９４℃，５ｍｉｎ；９４℃，２０ｓ，５６℃，３０ｓ，７２℃，４０ｓ，４０循环；７２℃，５ｍｉｎ。８．２．２．３　犘犆犚第二轮反应ＰＣＲ反应总体积２５μＬ。包括ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１Ｕ／μＬ）０．６μＬ、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５ μＬ、ｄＮＴＰｓ２．０μＬ、模板１．０μＬ（第一轮ＰＣＲ产物）、内引物ＩＮ  １（２０μｍｏｌ／Ｌ）及ＩＮ  ２（２０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ，补充ｄｄＨ２Ｏ使总体积达到２５μＬ。反应条件为：９４℃，５ｍｉｎ；９４℃，２０ｓ，５６℃，３０ｓ，７２℃，４０ｓ，４０循环；７２℃，５ｍｉｎ。８．３　琼脂糖凝胶电泳检测扩增结束后，在扩增产物中加入６×ＤＮＡ上样缓冲液，用含１×ＧｅｌＲｅｄ２）的１．５％琼脂糖凝胶电泳３犛犖／犜４００９—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.检测扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录结果