ICS 65.020 B 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3090—2019 绵羊幼畜超排技术规程 Juvenile in vitro embryo transfer technology standards regulations on sheep 2019 - 12 - 25 发布 吉林省市场监督管理厅 2020 - 02 - 01 实施 发 布 DB22/T 3090—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人：王春昕、张明新、侯健、赵云辉、赵卓、翟博、苑志宇、张莹、郭洋、闫凤祥、 关宏、马骏、柴浩晨、吴翠玲、宗兴龙、刘克雄、田浩、张玉梅、齐琪、段增祎。 I DB22/T 3090—2019 绵羊幼畜超排技术规程 1 范围 本标准规定了绵羊幼畜超排的技术流程图、卵母细胞采集、体外受精、胚胎鉴定和胚胎移植。 本标准适用于绵羊幼畜超排技术操作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 826 绵羊胚胎移植技术规程 NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 NY/T 1900 畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 幼畜超排 juvenile in vitro embryo transfer 从幼畜获取卵母细胞进行胚胎体外生产和移植的一套完整的综合技术体系，包括性成熟前动物激素 处理诱导卵母细胞发育、活体采卵、卵母细胞体外成熟、体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术的 过程。 3.2 超数排卵 superovulation 在母羊发情周期的适当时间，施以外源促性腺激素，促使母畜比自然状态有更多卵泡发育并排卵。 3.3 同期发情 estrus synchronization 通过外源激素处理等人为手段调整母羊的发情周期，使其在预定时间内集中发情的技术。 3.4 供体 donor 提供用于胚胎生产的卵母细胞的4-8周龄母羔羊。 3.5 受体 receptor 接受胚胎移植的成年母羊。 3.6 卵母细胞采集 oocytes collection 使用冲卵液将发育到一定时期的卵母细胞从卵巢中采集回收的过程。 1 DB22/T 3090—2019 3.7 胚胎移植 embryo transfer 将胚胎植入到同期发情的母羊输卵管或子宫内的过程。 3.8 精子体外获能 sperm in vitro capacitation 精子在体外经获能因子诱导，增加精子受精能力，改变膜的通透性，降低顶体膜稳定性，使精子辨 识卵子，穿入卵子受精的过程。 4 技术流程图 绵羊幼畜超排技术流程如图1所示。获得的卵母细胞和胚胎在体外进行操作时，应置于37 ℃恒温台 上，所用液体试剂应预热至38.5 ℃再进行使用。 图1 5 卵母细胞采集 2 绵羊幼畜超排技术流程图 DB22/T 3090—2019 5.1 供体、受体选择 5.1.1 选择健康、繁育性能良好的成年母羊作为受体，将放置阴道栓当天记为第 0 天，第 13 天撤栓并 注射 PMSG 400 IU/只，进行同期发情处理。 5.1.2 选择 4 周龄～8 周龄，体重在 5 kg～15 kg，有完整系谱档案的健康母羔作为供体。与母羊同圈 饲养，适量补饲羔羊料。 5.2 超数排卵 超数排卵操作应符合表1规定。绵羊幼畜超排技术实施计划见表1。 表1 周期 0日 11 日 绵羊幼畜超排技术实施计划表 12 日 13 日 注射 FSH 注射 FSH 14 日 15 日 16 日 20～22 日 试请 试情 胚胎移植 胚胎移植 卵母细胞 卵母细胞 2～4 桑葚胚、 体外成熟 体外受精 细胞期 囊胚 注射 1 次 PMSG 330 IU/只 注射 FSH 供卵羊 30 IU/只。 每天 2 次， 30 IU/只。 30 IU/只。 每天 2 次， 每天 2 次， 间隔 12 h 手术采卵 间隔 12 h 间隔 12 h 放置 受体羊 阴道 PMSG 栓 400 IU/只 卵母细胞、胚胎 5.3 撤栓，注射 采集方法 第14天，手术法暴露供体卵巢，用含有2 mL吸卵缓冲液的20 G针头一次性注射器刺吸法采集卵巢卵 泡中的卵母细胞。吸卵缓冲液配方应符合附录A.1的规定。 5.4 挑选卵母细胞 将吸取卵母细胞后的吸卵缓冲液放入培养皿中，在体视显微镜下挑选出形态完整、胞质均匀、有多 层卵丘细胞紧密包围的卵丘—卵母细胞复合体。 5.5 卵母细胞体外成熟 5.5.1 将挑选出的卵丘—卵母细胞复合体先用吸卵缓冲液中清洗 3 次，再在成熟培养液清洗 2 次。 5.5.2 转入预先在 CO2 培养箱中平衡 2 h 以上的四孔细胞培养皿中，每孔 600 µL 成熟培养液，上覆 盖 300 µL 液体石蜡油。成熟培养液配方应符合附录 A.2 的规定。 5.6 培养条件 每孔 30 枚～40 枚，培养条件为 38.5 ℃，5% CO2，95% 空气，饱和湿度，成熟时间为24 h。 6 体外受精 3 DB22/T 3090—2019 6.1 精子解冻 将绵羊冻精从液氮中取出，在38 ℃水浴中快速解冻。 6.2 精子获能方法 将解冻的精液加入装有预先在CO2培养箱中平衡2 h以上的500 µL受精液的圆底玻璃试管底部，置于 CO2培养箱中上游孵育获能处理 20 min～30 min，显微镜下观察精子活力及密度。受精液配方应符合附 录A.3的规定。 6.3 成熟卵母细胞收集 将成熟培养 24 h 的卵丘—卵母细胞复合体移入含 0.2%透明质酸酶的 Hepes-TCM199 溶液中。 0.2%透明质酸酶和Hepes-TCM199 溶液配方应符合附录A.4、A.5的规定。 6.4 成熟卵母细胞处理 6.4.1 吹打法处理卵丘—卵母细胞复合体，去除大部分颗粒细胞，仅保留 1 层～3 层，再用受精液清 洗 3 次。 6.4.2 转入预先在 CO2 培养箱中平衡 2 h 以上的四孔细胞培养皿中，每孔 40 枚～50 枚成熟的卵母细 胞，450 µL 受精液，上覆 300 µL 液体石蜡油。 6.5 受精 取上层的精子加入放有成熟卵母细胞的四孔板中，每孔加入约 80 µL 精子悬液，精子的密度约为 1 5 ×10 个/mL。受精条件为 38.5 ℃，5% CO2，95% 空气，饱和湿度，受精时间 20 h～24 h。 6.6 早期胚胎鉴定 6.6.1 选取 2～4 细胞期的胚胎进行输卵管移植或继续培养。 6.6.2 继续发育培养的胚胎和未卵裂假定合子转入体外成熟液中进行体外发育培养 4 h～8 h，培养条 件为 38.5℃，5% CO2，5% O2，90% N2，饱和湿度。每孔 20 枚～30 枚胚胎，再进行胚胎鉴定和分级， 达到 2～4 细胞期的胚胎进行输卵管移植或继续培养。 6.7 囊胚期胚胎处理 将2～4细胞期胚胎培养24 h，转入预先在 CO2培养箱中平衡 2 h 以上的四孔细胞培养皿中，每孔 600 µL SOF-AA培养液，上覆盖 300 µL 液体石蜡油继续培养96 h～108 h，每48 h半量置换培养液。SOF-AA 培养液配方应符合附录A.6的规定。 6.8 囊胚期胚胎培养条件 培养条件为 38.5 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2，饱和湿度。培养48 h后间隔6 h～8 h观察胚胎发育 状况，达到囊胚期胚胎可进行子宫角移植或冷冻保存。 7 胚胎鉴定 7.1 7.2 4 胚胎鉴定技术应符合 NY/T 1674 的规定，进行胚胎体外培养各阶段的质量鉴定和分级划分。 检出的可用胚胎应尽快冷冻保存或移植。冷冻方法应符合 NY/T 1900 的规定。 DB22/T 3090—2019 8 胚胎移植 胚胎移植技术应符合NY/T 826和NY/T 1571规定。 5 DB22/T 3090—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 绵羊幼畜超排技术主要试剂 A.1 吸卵缓冲液 H199 + 50 mg/mL Sodium Heparin + 100 µg/mL streptomycin + 100 IU/mL penicillin。 A.2 成熟培养液 TCM199 + 10 µg/mL FSH+ 10 µg/mL LH + 1 µg/mL β-estradiol +100 µg/mL streptomycin + 100 IU/mL penicillin。 A.3 受精液 SOF +100 µg/mL streptomycin + 100 IU/mL penicillin。 A.4 0.2%透明质酸酶 Hyaluromolase 0.2g 溶于10 mL DPBS，过滤分装，用时稀释 10 倍。 A.5 Hepes-TCM199 TCM199+5.2 mg/mL Hepes。 A.6 SOF-AA SOF + 2% EAA + 1% NEA + 8mg/mL BSA。 _________________________________ 6