(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211299191.7 (22)申请日 2022.10.22 (71)申请人 河北御芝林生物科技有限公司 地址 050000 河北省石家庄市高新区海河 道168号 申请人 河北御芝林药业有限公司 (72)发明人 王光路　朱志铭　赵大鹏　张赞　 李丽丽　张玉洁　葛亚哲　 (51)Int.Cl. G01N 30/06(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (54)发明名称 维生素D供试品溶液的制备方法及维生素制 品中维生素D的检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种维生素D供试品溶液的制备 方法， 包括待测样品DMSO超声溶解和甲醇定容两 个步骤， 能够大幅缩短维生素D供试液制备时间， 有利于后续检测过程中降低维生素D含量测试误 差， 最终能够实现准确反映被检测样品中维生素 D真实含量的目的。 解决了现有技术中样品前处 理过程复杂且耗时长的问题。 同时， 本发明的维 生素D供试液制备方法还能够节约检测成本， 亦 有利于提升整个检测方法的效率。 此外， 本发明 还涉及一种维生素D检测方法， 仅采用高效液相 色谱的反相检测系统， 进一步节省检测时间、 节 省检测成本的同时， 还具有专属性更强、 线性更 佳、 重复性更佳、 准确度更高、 稳定性更强、 检出 限更低、 精密度更好的优势。 权利要求书1页 说明书18页 附图11页 CN 115436544 A 2022.12.06 CN 115436544 A 1.一种维生素D供试品溶液的制备方法， 用于维生素制品中维生素D的检测， 其特征在 于： 包括下列步骤： S1： 向所述维生素制品中加入二甲基亚砜， 后超声提取， 得到提取 液； S2： 向所述 提取液中加入甲醇， 后过 滤得到滤液， 即得。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 所述维生素制品为维生素D含片、 维生 素D咀嚼片、 维生素D颗粒剂和维生素D 片剂中的任意 一种。 3.根据权利要 求1‑2中任一所述的制备方法， 其特征在于： 所述维生素D 包括维生素D2或 维生素D3。 4.根据权利要求1 ‑3中任一所述的制备方法， 其特征在于： 步骤S1中， 所述维生素制品 与所述二甲基亚砜的质量比为1： 1.1～1 1。 5.根据权利要求4中所述的制备方法， 其特征在于： 步骤S1中， 超声时间为10～30min； 优选的， 超声时间为10mi n。 6.根据权利要求1 ‑5中任一所述的制备方法， 其特征在于： 步骤S2中， 所述维生素制品 与所述甲醇的质量比为1： 1 1.9～79.1。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 步骤S2中， 过滤选用0.22μm滤膜或 0.45 μm滤膜。 8.一种维生素制品中维生素D的检测方法， 其特 征在于： 包括下列步骤 a、 制备维生素D供试品溶液： 按照权利要求1～7中任一所述的制备方法， 制备维生素D 供试品溶液； b、 制备维生素D标准储备 溶液， 后按照浓度梯度配制多份维生素D标准系列溶 液； c、 高效液相色谱检测： 采用高效液相色谱法对所述维生素D供试品溶液和多份所述维 生素D标准系列溶 液进行检测， 根据检测结果计算得到维生素D的含量。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于： 步骤b 中， 所述维生素D标准储备溶液 的浓度为100u g/mL， 和/或多份所述维生素D标准系列溶液的浓度 分别为0.05 μg/mL、 0.10 μ g/mL、 0.20 μg/mL、 0.40 μg/mL、 0.6 0 μg/mL、 1.0 0 μg/mL。 10.根据权利要求8 ‑9中任一所述的检测方法， 其特征在于： 步骤c中， 高效液相色谱法 的条件为以下(i)至(vi)中的一项或多 项： (i)色谱柱： C18柱， 内径4.6m m， 粒径5 μm； (ii)柱温： 3 0～40℃； (iii)流动相： 包括流动相A和流动相 B； 所述流动相A为甲醇， 所述流动相 B为水； 所述甲 醇与所述水的体积比为95： 5； (iv)流速： 0.8～1.2mL/mi n； (v)检测波长： 264 nm； (vi)进样量： 10 0 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115436544 A 2维生素D供试品 溶液的制备方 法及维生素制品中维生素D的检 测方法 技术领域 [0001]本发明涉及化学分析技术领域， 具体涉及一种维生素D供试品溶液的制备方法。 同 时， 本发明还涉及一种维生素制品中维生素D的检测方法。 背景技术 [0002]维生素D， 一种脂溶性维生素， 乃环戊烷多氢菲类化合物， 一组结构上与固醇有 关， 功能上可防止佝偻病的维生 素， 最主要的是维生 素D3与D2。 维生素D 的主要功用是促进小肠 粘膜细胞对钙和磷的吸收， 有利于新骨生 成和钙化。 此外， 维生素D还有促进皮肤细胞生长、 分化及调节免疫功能作用。 一般成年人经常接触日光不致发生缺乏病， 婴幼儿、 孕妇、 乳母 及不常到户外活动的老人要增加维生素D供给量到每日10 μg(相当于400国际单位)。 由此， 维生素D的含量检测， 成为必不可少的环 节。 [0003]目前， 普遍采用国标GB5009.82 ‑2016皂化法进行维生素D的含量检测， 但 该检测方 法存在检测步骤繁琐、 检测前处理复杂、 检测专属性不强、 测试周期长等问题。 尤其是检测 前处理步骤， 包括皂化处理、 石油醚提取、 洗涤、 浓缩步骤， 存在过程复杂且耗时长的问题。 另外， 由于维生素D本身不稳定、 易氧化、 易分解的性质， 冗长的时间会导致维生素D含量测 试误差加大， 无法准确反映被 检测样品中维生素D的真实含量。 [0004]CN110632203A涉及一种同步快速检测维生素A、 维生素D3和维生素E的方法， 包括 如下步骤： (1)采用二甲基亚砜提取待测样品中的维生素A、 维生素  D3和维生素E， 得到的提 取液经正己烷震荡萃取、 浓缩、 复溶后得到样品溶液；  (2)配制维生素A、 维生素D3、 维生素E 的标准溶液， 按照浓度梯度配制多份标准系列溶液； (3)采用高效液相色谱法对 所述样品溶 液和标准品溶液进行检测分析， 利用外标法得到维生素A、 D3、 E的含量。 该检测 方法可实现 维生素A、 D3、 E的同步检测， 能够大幅缩短样品前处理时间， 提高工作效率， 同时提高了检 测精度， 降低实验室成本 。 [0005]CN114324648A公开了含维生素D3的制剂中有关物质的高效液相检测方法及供试 品溶液的制备方法， 本发明供试品溶液 的制备方法提取率高、 且重现性好， 适于推广应用； 且供试品溶液制备方法用到的有机溶剂种类相对较少、 毒性相对较低， 减少 了实验人员的 操作风险。 本发明首次采用反相高效液相系统对含低剂量维生素D3的制剂中的有关物质进 行检测， 相比现有技术中的正相检测系统， 其专属性更强、 重现性更好、 灵敏度更高， 采用本 发明的梯度洗脱方式， 各主峰与杂质峰均可被检出并良好分离， 并且主峰的响应度高， 可有 效控制含维生素  D3的制剂的质量。 [0006]CN110632203A和 CN114324648A均用其他步骤代替了皂化反应且用其他步骤代替 了石油醚提取步骤， 在一定程度上缩短了样品前处理时间， 对于提高检测效率有一定程度 的提升。 但是， 两者对于样品前 处理的处理 时间仍有 些许过长， 且均未对检测方法的稳定性 进行验证。 [0007]鉴于此， 开发一种能够大幅缩短维生素D供试液制备时间的方法， 以降低维生素D说　明　书 1/18 页 3 CN 115436544 A 3