(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211186080.5 (22)申请日 2022.09.27 (71)申请人 湖南泰新医药 科技有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市长沙高新开发 区麓天路28号金瑞麓谷科技园B-1栋 501号 (72)发明人 尹小丽　 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种测定人血浆中熊去氧胆 酸及其代谢物浓度的方法， 该方法采用蛋白沉淀 法进行前处理、 LC ‑MS/MS对人血浆中熊去氧胆酸 及其代谢物进行定量检测。 本发 明方法前处理操 作简单， 可同时检测UDCA和GUDCA、 TUDCA， 检测灵 敏度高， 分析时间短， 重现性好， 准确度高， 不受 基质干扰。 本发 明方法能够满足人体药代动力学 要求， 可应用于临床药代动力学研究。 权利要求书2页 说明书15页 附图4页 CN 115469035 A 2022.12.13 CN 115469035 A 1.一种测定人 血浆中熊 去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)样品前处理： 取待测样品， 加入内标工作液， 涡旋； 加入沉淀剂， 涡旋振荡， 离心； 取 上清液稀释， 进行LC ‑MS/MS分析； (2)液相色谱 ‑质谱联用检测： 色谱条件： 色谱柱： Gemini  NX‑C18 110A， 3.0 ×50mm 3.0micron， Phenomenex， 保护柱： Gemini C18， 4×3.0mm， Phenomenex， USA； 流动相A： 2mM乙酸铵水溶液； 流动相B∶2mM乙酸铵 水溶液∶ 甲醇∶ 乙腈体积比为2 ∶20∶80； 洗脱方式为梯度洗脱； 质谱条件： 采用ESI源， 负离 子MRM模式检测； (3)标准曲线制备： 将标准曲线样品按步骤(1)处理， 按步骤(2)采用LC ‑MS/MS方法检 测； 记录每个浓度的待测物对应的峰面积， 以待测物和内标的峰面积比值为 纵坐标， 以待测 物浓度为横坐标， 制备 标准曲线回归方程； (4)待测物测定： 将待测 血浆按步骤(1)处理， 按步骤(2)采用LC ‑MS/MS方法检测， 记录 待测物对应的峰面积， 将待测物的色谱峰面积与内标峰面积的比值代入获得的标准曲线回 归方程， 计算测定的待测物的相应浓度， 并减去空白血浆中待测物浓度。 2.根据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在 于， 所述沉淀剂为甲醇； 所述涡旋的时间为30s； 所述涡旋振 荡时间为5 min； 所述离心条件为 2490g， 10mi n。 3.根据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在 于， 所述色谱条件还包括： 进样量： 20 μL； 柱温： 30℃； 梯度洗脱程序为： 0.00 ‑0.20min， 70％ 流动相A； 0.21 ‑3.80min， 70％流动相A下降至35％流动相A； 3.80 ‑3.81min， 35％流动相A下 降至2％流动相A； 3.81 ‑4.80min， 2％流动相A； 0.00 ‑3.80min流动相 流速为0.500mL/min， 3.81‑4.80min流动相流速为0.75 0mL/min。 4.根据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在 于， 所述质谱条件还包括： 电喷雾电压： ‑4500V； 离子喷雾温度： 500℃； Gas1： 60psi； Gas2： 65psi； CUR： 3 5psi； CAD： 9psi； 监测离子反应条件分别为： 质谱切换阀设置如下： Total Time(min) Position权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115469035 A 21 1.0 B 2 4.5 A 。 5.根据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在 于， 所述内标工作液中的内标为UDCA ‑d4、 GUDCA ‑d5、 TUDCA ‑d5； 所述内标工作液为UDCA ‑d4、 GUDCA‑d5、 TUDCA‑d5的混合内标， 浓度分别为 400、 200、 200ng/mL。 6.据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在于， 所述标准曲线样品的配制过程： 分别称取UDCA、 GUDCA、 TUDCA对照品， 以甲醇溶解并定容， 得 到浓度分别为1.000mg/mL、 1.000mg/mL、 0.9559mg/mL的标准品储备液； 吸取上述UDCA、 GUDCA、 TUDCA储备液， 以体积比为1∶1的甲醇 ‑水溶液逐级稀释得到系列浓度混合标准品工 作液； 取混合标准品工作液， 稀释到PBS中， 配制待测物标准曲线样品。 7.根据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在 于， 所述上清液稀释是指取 上清液加入等体积的超纯 水进行稀释。 8.根据权利要求1所述的测定人血浆中熊去氧胆酸及其代谢物浓度的方法， 其特征在 于， 所述待测物标准曲线样品浓度： UDCA为30～5000ng/mL、 GUDCA为10～1000ng/mL、 TUDCA 为0.9560～95.60ng/mL； 所述待测物为UDCA、 GUDCA、 T UDCA。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115469035 A 3