(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211193247.0 (22)申请日 2022.09.28 (71)申请人 广州医药研究总院有限公司 地址 510240 广东省广州市海珠区江南大 道中134号 (72)发明人 殷玮　孙晶晶　倪庆纯　凌珊　 卢辉　周兰华　彭佳裕　戚园梅　 (74)专利代理 机构 广州广典知识产权代理事务 所(普通合伙) 44365 专利代理师 顾书玲　万志香 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 当归四逆汤中六种成分在血浆中的浓度的 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种当归四逆汤中六种成分 在血浆中的浓度的检测方法， 其是在血浆样品中 加入内标工作溶液和甲醇， 离心， 取所得上清液 作为待测血浆样品溶液； 对待测血浆样品溶液进 行液相色谱分离后， 进行质谱分析； 所述内标工 作溶液为450ng/mL～ 550ng/mL的吲哚美辛溶液。 本发明的检测方法， 可以有效检测当归四逆汤中 阿魏酸、 芍药苷、 甘草苷、 细辛脂素、 马兜铃酸A、 马兜铃酸B六种成分在血浆中的浓度， 操作简单、 分析快速、 特异性高、 分离度高， 可实现对服用当 归四逆汤后体内有效成分及毒性成分的同时监 控， 对推进当归四逆汤的进一步研发及安全性研 究， 极具现实意 义。 权利要求书2页 说明书15页 附图10页 CN 115494177 A 2022.12.20 CN 115494177 A 1.一种当归四逆汤中六种成分在血浆中的浓度的检测方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 在血浆样品中加入内标工作溶液和甲醇， 离心， 取所得上清液作为待测血浆样品溶液； 对待测血浆样 品溶液进行液相色谱分离后， 进行质谱分析； 所述内标工作溶液为450ng/mL ～550ng/mL的吲哚美辛溶 液。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述液相色谱分离 中梯度洗脱所采用 的流动相B为乙腈， 流动相A为含有1.6mM～2.4mM乙酸铵的乙酸溶液， 所述乙酸溶液的质量 百分浓度为0.08％～0.12％。 3.根据权利要求2所述的检测方法， 其特 征在于， 所述梯度洗脱程序为： 0～0.3分钟， 流动相B： 40 ±5％→40±5％； 0.3～1.2分钟， 流动相B： 40 ±5％→95±5％； 1.2～2.0分钟， 流动相B： 95 ±5％→95±5％； 2.0～2.2分钟， 流动相B： 95 ±5％→40±5％； 2.2～3分钟， 流动相B： 40 ±5％→40±5％。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述液相色谱的色谱条件 包括： 色谱柱： 以十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂的色谱柱； 流速： 0.4 ±0.05mL/min； 进样体积： 5.0 0±0.5 μL； 柱温： 40±5℃； 自动进样器温度： 4 ±4℃； 洗针液： 5 0±5％乙腈水 溶液； 洗冲速度： 3 0 μL/sec～40 μL/sec； 洗针液体积： 40 0 μL～600 μL。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述质谱分析的条件 包括： 离子化模式： 电喷雾 离子源； 正离 子模式； 多反应监测； 离子源参数： 气帘气： 20psi； 离 子源气体1： 3 0psi； 离子源气体2： 3 0psi； 离子源喷雾电压： 5 500±10V； 离子源温度： 5 00±10℃； 分辨率Q1/Q3： Un it/Unit； 碰撞气： Medium； 暂停时间： 20 ±1msec； 质谱采集时间为3.0 0±0.2min。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述质谱分析中， 各成分的四级杆质 谱条件为： 阿魏酸： 离子对： 192.5 →133.9； 去簇电压： ‑60.0V； 入口电压： ‑10.00V； 出口电压： ‑ 23.00V； 碰撞能量： ‑23.00eV； 停留时间： 10 0.0msec； 芍药苷： 离子对： 525.2 →449.3； 去簇电压： ‑60.0V； 入口电压： ‑10.00V； 出口电压： ‑ 23.00V； 碰撞能量： ‑19.00eV； 停留时间： 10 0.0msec； 甘草苷： 离子对： 417.1 →255.0； 去簇电压： ‑60.0V； 入口电压： ‑10.00V； 出口电压： ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115494177 A 223.00V； 碰撞能量： ‑28.00eV； 停留时间： 10 0.0msec； 细辛脂素： 离子对： 372.2 →233.0； 去簇电压： 60.0V； 入口电压： 10.00V； 出口电压： 25.00V； 碰撞能量： 12.0 0eV； 停留时间： 20 0.0msec； 马兜铃酸A： 离子对： 359.2 →298.0； 去簇电压： 60.0V； 入口电压： 10.00V； 出口电压： 25.00V； 碰撞能量： 25.0 0eV； 停留时间： 20 0.0msec； 马兜铃酸B： 离子对： 329.2 →237.8； 去簇电压： 60.0V； 入口电压： 10.00V； 出口电压： 25.00V； 碰撞能量： 25.0 0eV； 停留时间： 20 0.0msec； 吲哚美辛： 离子对： 358.0 →139.0； 去簇电压： 60.0V； 入口电压： 10.00V； 出口电压： 25.00V； 碰撞能量： 24.0 0eV； 停留时间： 20 0.0msec。 7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 采用Shimadzu  LC 30AD液 相色谱仪联合S ciex Qtrap 5500质谱仪进行液相色谱分离及质谱分析， 所采用的操作系统 为Analyst  1.6.3； 所采用的液相色谱柱为： ACQUITY HSS T3， Waters。 8.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 所述甲醇与所述血浆样品 的体积比为3～6： 1； 和/或， 所述血浆样品与内标工作溶液的体积比为1.5～2.5： 1； 和/或， 所述离心温度为3℃～5℃， 离心转速为25 00rpm～3500rpm， 离心时间为8mi n～12min。 9.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 所述血浆样品为人或动物 的血浆样品。 10.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法还包括制备 标准曲线样本和质控样本的步骤， 所述制备 标准曲线样本的方法为： 在空白血浆中加入混合标准曲线工作溶 液； 所述制备质控样本的方法为： 在空白血浆中加入混合质控工作溶 液； 所述制备混合标准曲线工作溶液和混合质控工作溶液均包括以下步骤： 分别用50 ± 5％甲醇水溶液梯度稀释浓度均为1.00mg/mL的阿魏酸、 芍药苷、 甘草苷、 细辛脂素、 马兜铃 酸A和马兜铃酸B标准品储备 溶液， 即得。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115494177 A 3