ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3091—2019 鹿结核病病原菌实时荧光 PCR 检测方法 Real-time PCR method for the detection of Tuberculosis pathogenic organism in deer 2019 - 12 - 25 发布 吉林省市场监督管理厅 2020 - 02 - 01 实施 发 布 DB22/T 3091—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学，中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：曾范利、李健明、时坤、宗颖、冷雪、赵丹、杜锐、徐超。 I DB22/T 3091—2019 鹿结核病病原菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的试剂仪器、操作程序、结果判定。 本标准适用于梅花鹿、马鹿组织器官、血液中的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR Real-time PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号量到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA 乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution） 5 原理 以 DNA 为模板进行PCR扩增，通过该反应，利用荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，是否获得目的基因，并最终计算待测 样品模板的初始浓度。 6 试剂和材料 1 DB22/T 3091—2019 6.1 试剂 除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 6.1.1 实时荧光 PCR 扩增所用的引物序列见表 1。 表1 类别 引物序列 核酸序列（5’-3’） 上游引物5’-AGACCCCGGGACCTTCACTACAAC-3’ 结核分枝杆菌 下游引物5’- AACGACTCCGCCCCAACTG -3’ 探针5’-FAM- ACGGTTTGTGTAGGATAGGTGGGA-TAMRA-3’ 上游引物5’- CGGGCGTTTTGTCGCATCC -3’ 牛分枝杆菌 下游引物5’-GGGCGTGGGCAGACTTCGT-3’ 探针5’-FAM-CTTGCGGAGGAGGTTGGGGACA –TAMRA-3’ 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.2 动物血液与组织 DNA 提取试剂盒。 Taq 酶。 磷酸盐缓冲液（PBS）(0.01 mol/L,pH 7.4)。 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)。 材料 6.2.1 6.2.2 6.2.3 7 离心管（50 mL、15 mL、1.5 mL）。 吸头（200 μL～1000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL）。 荧光定量 PCR 管。 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 8 电子天平，感量 0.01 g。 荧光定量 PCR 仪。 台式低温高速离心机（4 ℃，13000 r/min）。 移液器（200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL）。 恒温水浴锅。 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应按 GB 19489 和 GB/T 27401 的有关规定执行。 9 操作步骤 9.1 样品的采集和保存 9.1.1 组织样品的采集和保存 采集下颌、咽后、肺门、肠系膜淋巴结，肺，肝，脾等组织样品不少于 5 g。做好标识，置于密闭 容器内，冷冻或4 ℃冷藏保存和运输。 2 DB22/T 3091—2019 9.1.2 血液样品的采集和保存 使用EDTA作为抗凝剂，无菌采集静脉血不少于 5 mL， 样品采集后于 2 ℃～8 ℃ 冷藏保存，然后 立即运送实验室（夏季不超过 24 h，冬季不超过 2 d）。短时间不能送达的样品应于 -20℃ 冷冻保存。 样品运送时应保持冷冻状态，不应反复冻融。 9.2 DNA 提取 按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的 DNA。 9.3 对照样品 9.3.1 阳性对照 取结核分枝杆菌标准菌株灭活菌，牛结核分枝杆菌灭活菌作为阳性对照。 9.3.2 阴性对照 取标准阴性样品作为阴性对照。 9.3.3 空白对照 去离子水。 9.4 扩增反应体系 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 2。 表2 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 premix Ex TaqTM I (2×） 13.5µl 上游引物(0.4 μmol/L) 0.5 μL 下游引物(0.4 μmol/L) 0.5 μL 探针（0.3μmol/L） 1 μL 待检 DNA 模板 2 μL ddH2O 7.5 μL Total 25 μL 注：上游、下游引物为结核分枝杆菌的引物。 3 DB22/T 3091—2019 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 3。 表3 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 premix Ex TaqTM I (2×） 12.5µl 上游引物(0.3 μmol/L) 0.5 μL 下游引物(0.3 μmol/L) 0.5 μL 探针（0.2μmol/L） 1 μL 待检 DNA 模板 2 μL ddH2O 8.5 μL Total 25 μL 注：上游、下游引物为牛分枝杆菌的引物。 9.5 反应程序 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序见表 4。 表4 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 时间/s 温度/℃ 第一步 30 95 5 95 30 55 第二步（40 个循环） 注：荧光收集设置在每次循环55 ℃ 30 s时进行。 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序见表 5。 表5 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 时间/s 温度/℃ 第一步 30 95 5 95 30 60 第二步（40 个循环） 注：荧光收集设置在每次循环60 ℃ 30 s时进行。 4 DB22/T 3091—2019 10 结果判定 10.1 质控标准 10.1.1 阳性对照 阳性对照的 Ct 值应≤35.0，并出现特定的扩增曲线。 10.1.2 阴性对照 空白对照、阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.1.3 有效原则 如阳性对照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。 10.2 结果描述与判定 10.2.1 阳性结果 待检样品能够扩增出结核分枝杆菌或牛分枝杆菌 S 型曲线，并且 Ct 值在预期的范围之内（≤ 35.0）判为核酸阳性。 10.2.2 阴性结果 检测结果呈现无 Ct 值并且无扩增曲线的反应判为核酸阴性。 10.2.3 可疑结果 对于 35＜Ct 值＜40 的样品，应进行重复试验。如果重复试验的 Ct 值＜40，且曲线有明显的对 数增长期，判为核酸阳性反应。 5 DB22/T 3091—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.4）的配制 称取 8 g NaCl、 0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和 0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL 蒸馏水中，用盐酸 （HCl）调 pH至 7.4，定容至 1L ，采用 (121±2)℃/0.1 MPa高压下蒸气灭菌（至少 20 min），保存 于室温或 4 ℃冰箱中。或按照商品化说明书配制。 A.2 0.5mol／L EDTA(pH 8.0) 的配制 称取186.1 g EDTA，加入800 mL 蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(NaOH)调pH至8.0， 定容至1 L，分装，采用(121±2)℃/0.1MPa，15 min高压灭菌后贮存于室温。 _________________________________ 6