ICS 65.020.30 B 44 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 863—2019 水产微生态制剂 解淀粉芽胞杆菌生产技术 规程 Aquatic probiotics---Technical regulation for production of Bacillus amyloliquefaciens 2019 - 01 - 14 发布 天津市市场监督管理委员会 2019 - 02 - 15 实施 发 布 DB12/T 863—2019 前 言 本标准依据GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求起草。 本标准由天津市农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业生物技术研究中心。 本标准主要起草人：谢凤行、张峰峰、周可、赵琼、赵玉洁、孙海波、高宝山。 I DB12/T 863—2019 水产微生态制剂 解淀粉芽胞杆菌生产技术规程 1 范围 本标准规定了解淀粉芽胞杆菌生产中所涉及的生产环境和设备、生产技术流程、质量检测和储运。 本标准适用于水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3838 地表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 GB/T 26428 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 解淀粉芽胞杆菌 bacillus amyloliquefaciens 属于芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，杆状，有鞭毛，革兰氏阳性菌，芽胞椭圆形，中生或近中生。 3.2 原菌种 the original strain 由单菌落分离纯化，并在固体斜面上繁殖保存的菌种。 3.3 一级菌种 first class strain 原菌种在培养皿上活化，挑取单菌落接种至三角瓶中，振荡培养的菌种。 3.4 二级菌种 second class strain 三角瓶中的菌种接种至种子罐中，在种子罐中放大培养的菌种。 4 生产环境和设备要求 4.1 生产环境 4.1.1 厂区空气质量符合大气环境质量标准 GB 3095 中Ⅱ类要求。 4.1.2 发酵用水符合地表水环境质量标准 GB 3838 中Ⅲ类水质要求，冷却水及其他用水符合该标准中 Ⅳ类水质要求。 4.1.3 生产车间配备消毒灭菌设施，菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。 1 DB12/T 863—2019 4.2 生产设备 生产设备需为不锈钢发酵罐，体积根据生产规模自定。 5 生产技术流程 5.1 生产流程 生产技术流程见附录A 5.2 菌种质量 5.2.1 用于发酵的菌种应有菌种鉴定报告或菌株来源相关信息。 5.2.2 在发酵前应先检测菌种的纯度和性能，如不纯或退化，应先进行提纯复壮。 5.2.3 菌种在上罐生产之前需检测种子罐中菌体的纯度和浓度，不能有杂菌污染，浓度达到每毫升亿 级以上。 5.3 培养基 5.3.1 原菌种和一级菌种的培养基应保证菌种生长的延滞期短，生长旺盛，碳、氮源营养丰富。 5.3.2 二级菌种培养基原则上为发酵培养基或接近发酵培养基。 5.3.3 发酵培养基在保证菌体生长旺盛，利于芽胞形成的前提下，尽量利用来源充足、价格低廉的原 料。 5.4 灭菌 5.4.1 液体发酵，发酵罐的装液量 50%～70%，液体培养基、发酵设备、管道、补料罐等采用高压蒸汽 灭菌，灭菌条件为 121 ℃～125 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，灭菌 20 min～30 min。 5.4.2 固体物料含水率 50%～60%，121 ℃～130 ℃，灭菌 1.0 h～2.0 h。 5.4.3 灭菌后无菌操作取灭菌后的培养基，制片，染色，镜检，无微生物说明灭菌彻底，若有，需重 复 5.3 的工作。 5.5 接种 摇瓶种子到发酵罐种子接种量为1%～5%，种子罐到发酵罐接种量为5%～7%。接种保证无菌操作，调 节进、排气阀，使接种口有气体排出。 5.6 发酵 5.6.1 芽胞杆菌的发酵温度为 25 ℃～37 ℃。 3 3 5.6.2 液体发酵在发酵过程中通入无菌空气，通气量为 10 m /h•t～20 m /h•t，搅拌转数 80 r/min～ 150 r/min。 5.6.3 芽胞率达到 80%以上终止发酵。 5.6.4 发酵周期 24 h～48 h。 5.6.5 发酵过程加入天然油脂类或有机硅类消泡剂，可采用蠕动泵添加，也可在配置培养基时加入。 5.7 发酵后处理 4 发酵后的液体菌剂直接分装，或用沸石粉、凹凸棒土等载体吸附，载体的杂菌率≤1.0×10 CFU/g， 固体发酵菌剂直接风干。包装容器应灭菌处理。 2 DB12/T 863—2019 6 质量检测 6.1 检测指标 每个批次的产品抽样检测包括感官、水分、有效活菌数、芽胞率、杂菌率等指标，检验合格方可出 厂。 6.2 感官检测 6.2.1 取液体菌剂约 250 mL（固体菌剂约 250 g）于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。 6.2.2 液体菌剂为淡黄色或棕黄色，存放过程中可能出现沉淀，具清淡的腥味；固体菌剂棕色或浅棕 色，具有明显的发酵气味。 6.3 有效活菌数、芽胞率检测 6.3.1 样品稀释 液体菌剂用灭菌0.85%的生理盐水梯度稀释，固体菌剂稀释方法按照GB 26428规定执行。 6.3.2 涂平板 -6 -7 -8 有效活菌测定直接用2～3个梯度稀释液（10 、10 、10 ）在含淀粉的培养基(参见附录B)上涂平 板，每个梯度涂3个平板，芽胞数则将2～3个梯度稀释液80 ℃处理10 min后在含淀粉的培养基(参见附 录B)上涂平板。 6.3.3 培养 将涂好的平板在室温中放置15 min，使接种物完全被琼脂吸收，倒置于培养箱中37 ℃培养48 h。 6.3.4 计数 选取菌落数在30～300个之间的平板计数，典型的解淀粉芽胞杆菌菌落表面粗糙，不透明，边缘不 规则，呈浅米黄色，消耗培养基中的淀粉在菌落周围产生透明圈。芽胞数除以菌数即为芽胞率。 6.4 杂菌率的测定（好氧或兼性厌氧杂菌） -5 -6 -7 从用来测定有效活菌数且已经过10倍系列稀释的样品中，选取10 、10 、10 3个稀释度进行杂菌 率测定。平板计数法，按GB 20287执行。 6.5 固体菌剂水分含量测定 按GB 20287执行。 7 储运 7.1 应贮存在通风、干燥、清洁的仓库，仓库内无有害气体、易燃易爆物品及有腐蚀性的化学物品， 远离热源。 7.2 长途运输时，防止日晒、雨淋，避免长期受压和机械损伤。产品不应和易燃、易爆、易腐蚀的物 品同车（或其他运输工具）装运。 A 3 DB12/T 863—2019 附 录 A （规范性附录） 解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图 原菌种 配置培养基 纯度和性能检查 灭菌 一级菌种 接种 二级菌种 发酵 无菌空气 发酵物检测 不合格 合格 按规定处理 发酵后处理 质量检测 不合格 合格 按规定处理 出厂 图A.1 解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图 4 DB12/T 863—2019 BB 附 录 B （资料性附录） 计数用培养基 含淀粉培养基成分（每升培养基含量）: ——可溶性淀粉：10 g； ——蛋白胨：10 g； ——硫酸镁：0.5 g； ——磷酸氢二钾：1 g； ——碳酸钙：1 g； ——琼脂：18 g； ——蒸馏水：1000 mL； ——pH:7.0-7.5； ——灭菌条件：121 ℃灭菌 20 min。 _________________________________ 5