(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211045408.1 (22)申请日 2022.08.30 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大学东路174 号 (72)发明人 劳水兵　刘丽辉　黄穗萍　周其峰　 覃国新　李其利　佘永新　何洁　 莫仁甫　杨玉霞　李慧玲　罗丽红　 王淼　 (74)专利代理 机构 广西中知华誉知识产权代理 有限公司 45140 专利代理师 陆丽婷 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01)G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种香蕉枯萎病色谱检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种香蕉枯萎病色谱检测方 法， 其通过对香蕉枯萎病代谢毒素 ‑‑白浆菌素和 镰刀菌酸同时检测， 间接鉴定枯萎病菌及其发生 程度， 具体包括如下步骤： 将待测样品进行预处 理； 称取预处理后的待测样品， 按比例加入酸性 乙腈提取液， 涡旋提取后加入盐包后继续涡旋， 离心取上清液， 将上清液通过固相萃取小柱净 化； 采用超高压液相色谱串 联质联仪对净化液进 行梯度洗脱分离， 采用电喷雾ES+离子源， 多反应 监测进行质谱检测。 与传统的病原菌鉴定相比， 本发明操作简便， 灵敏度高， 重复性好， 可用于香 蕉及其它作物中枯萎病菌的鉴定和定量分析， 将 为香蕉及其它作物健康种苗生产和质量控制， 农 作物种植地土壤环境条件风险评估方面提供检 测数据支持。 权利要求书2页 说明书8页 附图1页 CN 115389669 A 2022.11.25 CN 115389669 A 1.一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 其对香蕉枯萎病代谢毒素 ‑‑白僵菌素 和镰刀菌酸的分离和同时检测， 具体包括如下步骤： S1样品预处理： 向待测样品中加入蒸馏水后匀浆或将待测样品直接匀浆/混匀得到待 测预处理样品； S2样品的提取与净化： 准确称取步骤S1得到的待测预处理样品， 向待测预处理样品中加入提取溶剂后涡旋提 取0.5～2.0min后得到提取液， 向提取液中加入盐包后继续涡旋1min， 于4000r/min下离心2 ～10min， 将上清液通过固相萃取小柱净化， 收集净化液后过0.22 μm有机微孔滤膜； 所述待 测预处理样品与提取溶剂的比例为 1g:1～4ml； 所述提取溶剂为酸性乙腈提取液； 所述固相 萃取小柱是装有C18、 PSA、 无水硫酸镁的固相萃取小柱； S3分离与测定： 采用超高压液质联用仪对步骤S2中通过有机微孔滤膜后的净化液进行梯度洗脱分离 和质谱检测， 其液相洗脱分离条件如下： 色谱柱： ACQUITY  UPLC@HSS T3； 流动相A： 甲酸水 溶液， 甲酸体积百分比为0.0 5‑0.5％； 流动相B： 甲酸乙腈溶 液， 甲酸体积百分比为0.0 5％～0.5％； 流速： 0.25mL/mi n， 柱温35℃， 进样量2 μL； 梯度洗脱程序： 白僵菌素保留时间4.68mi n， 镰刀菌酸保留时间2.71mi n； 其质谱检测条件如下： 质谱条件： 采用电喷雾 离子源ES+， 多反应监测(MRM)检测； 毛细管电压： 3.0KV； 离子源温度： 3 50℃； 脱溶剂气为N2； 脱溶剂气流速： N2， 400～1000L/h； 锥孔气流速： N2， 150L/h； 碰撞气流速： A r， 0.10mL/ Min； 毒素的质谱参数调谐如下： 白僵菌素： 定量离子对784.27>134.09， 锥孔电压54V， 碰撞能量30eV； 定性离子对 784.27>244.05， 锥孔电压 54V， 碰撞能量24eV；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115389669 A 2镰刀菌酸： 定量离子对为180.08>65.06， 锥孔电压74V， 碰撞能量50eV； 定性离子对 180.08>9 2.03， 锥孔电压74V， 碰撞能量24eV。 2.根据权利要求1所述的一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述 酸性乙腈提取液中含有酸性物质， 所述酸性物质为甲酸、 乙酸或盐酸中的一种； 所述酸性物 质的体积百分比为0.0 5％～2％。 3.根据权利要求2所述的一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述 酸性乙腈提取液中含有体积百分比为0.5％的乙酸。 4.根据权利要求1所述的一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 所述盐包含有无 水氯化钠、 无 水硫酸钠、 无 水硫酸镁、 柠檬酸钠、 柠檬酸 二钠中一种或几种。 5.根据权利要求1所述的一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 所述固相萃取小 柱内填有5 0mg C18、 50mg PSA、 150mg无水硫酸镁。 6.根据权利要求1所述的一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 步骤S3中， 所述 甲酸水溶液中， 甲酸的体积百分比0.1％； 所述甲酸乙腈溶 液中， 甲酸的体积百分比0.1％。 7.根据权利要求1所述的一种香蕉枯萎病色谱检测方法， 其特征在于， 步骤S1中， 所述 样品为含枯萎病菌代谢毒物的香蕉样品和土壤样品， 所述 香蕉样品包括 香蕉的茎、 叶、 果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115389669 A 3