(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210912200.9 (22)申请日 2022.07.30 (71)申请人 瑞普高科 （天津） 生物技 术有限公司 地址 300380 天津市西青区辛口镇泰兴 路6 号办公楼三层 (72)发明人 李虹颖　李守军　刘爱玲　王一凡　 廖茂梁　刘心怡　耿玉萌　 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种防治家禽传染性鼻炎中药制剂指纹图 谱的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种防治家禽传染性鼻炎的 中药制剂指纹图谱的检测方法， 采用高效液相进 行检测， 具体包括以下步骤： (1)对照品溶液的制 备； (2)供试品溶液的制备； (3)采用高效液相 色 谱‑紫外检测进行分析； (4)提取特征色谱峰， 建 立指纹图谱。 本发明具有方法简便、 客观性强等 优点， 有利于对防治家禽传染性鼻炎中药制剂 进 行质量控制。 权利要求书2页 说明书18页 附图4页 CN 115184509 A 2022.10.14 CN 115184509 A 1.一种防治家禽传染性鼻炎中药制剂指纹图谱的检测方法， 其特征在于， 所述指纹图 谱检测方法为采用HPLC检测法同时对绿原 酸、 蒙花苷、 木犀草素、 木兰脂素和欧前胡 素的含 量进行检测； 检测步骤如下： (1)对照品溶液的制备； (2)供试品溶液的制备； (3)采用高效液 相HPLC色谱 ‑紫外检测进行分析； (4)提取 特征色谱峰， 建立指纹图谱。 2.根据权利 要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述HPLC色谱条件如下： 色 谱柱为Supfex JX‑C18， 5 μm， 4.6 ×250mm； 以纯乙腈为流动相A， 0.1％甲酸/ 水为流动相B， 进 行梯度洗脱， 洗脱条件为： 0～35min， 8％～15％A； 35～75min， 15％～30％A； 75～110min， 30％～40％A； 1 10～150min， 40％～6 0％A； 150～155min， 60％～40％A。 3.根据权利 要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述HPLC检测条件为： 柱温为30℃； 流 速为1.0ml/mi n； 检测波长为25 0nm。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述对照品溶液的制备方 法为分别称取绿原酸、 蒙花苷、 木犀草素、 木兰脂素和欧前胡素对照品， 用甲醇分别稀释制 得储备液； 将各储备 液混合制得对照品溶 液。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)所述供试品溶液的制备方法 为： 精密称取防治家 禽传染性鼻炎中药制剂， 加入50％甲醇/水溶液， 称 重， 超声， 放至 室温， 再称重， 补足减失重量， 过 滤， 即得。 6.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述各储备液中， 绿原酸储 备液中绿原酸含量为500 μg/ml、 蒙花苷储 备液中蒙花苷含量为1000 μg/ml、 木犀草素储 备液 中木犀草素含量为1000 μg/ml、 木兰脂素储备液中木兰脂素含量1000 μg/ml、 欧前胡素储备 液中欧前胡素含量为100 μg/ml； 所述对照品溶液中绿原酸浓度50 μg/ml、 蒙花苷浓度100 μg/ ml、 木犀草素浓度为10 0 μg/ml、 木兰脂素浓度10 0 μg/ml和欧前胡素浓度10 μg/ml。 7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(4)中所述的特征色谱峰分别为 绿原酸、 蒙花苷、 木犀草素、 木兰脂素和欧前胡素； 所述特征峰的保留时间分别为： 绿原酸 20.843～20.966min、 蒙花苷73.046～73.294min、 木犀草素76.478～76.69 1min、 木兰脂素 115.218～1 15.453min、 欧前胡素134.786～134.910mi n。 8.一种基于谱效关系的防治家禽传染性鼻炎中药制剂的质量检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)按照权利要求1 ‑7中任一所述的方法建立防治家禽传染性鼻炎的中药制剂的HPLC 指纹图谱检测方法； (2)测定防治家禽传染性鼻炎中药制剂的抗炎活性； (3)将步骤(1)所识别特征峰的峰面积和步骤(2)所得的抗炎活性进行灰色关联度分 析， 并计算各 特征峰与抗炎活性之间的关联度， 评价特 征峰的抗炎活性。 9.根据权利要求8所述检测方法， 其特征在于， 步骤(2)所述测定防治家禽传染性鼻炎 中药制剂的抗炎活性的试验分为预防炎症试验和直接抗炎试验； 所述预防抗炎试验为： 将 RAW264.7细胞密接于96孔板， 24h后将防治家禽传染性鼻炎中药制剂的样品溶液加入细胞 中培养， 培养6h后弃去含药培养基， 再加入LPS诱导细胞炎症， 诱导24h后， 测 定细胞上清液 中NO释放量及IL ‑6、 TNF‑α 水平； 所述直接抗炎试验为： 将RAW264.7细胞密接于96孔板， 24h 后加入LPS诱导细胞炎症， 同时将防治家 禽传染性鼻炎中药制剂的样品溶液加入细胞中， 作 用24h后， 测定细胞 上清液中NO释放 量及IL‑6、 TNF‑α 水平。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115184509 A 210.根据权利要求8所述的检测方法， 其特 征在于， 所述灰色 关联度分析步骤如下： (1)将各样品的抗炎活性指标组成参考数列， 将各样品的指纹图谱中的各特征峰峰面 积组成比较数列； (2)对步骤(1)中所述的参 考数列和比较数列采用均质化方法进行 无量纲化处 理； (3)根据步骤(2)所得无量纲化处理的参考数列和比较数列， 计算各特征峰与抗炎活性 之间的关联度； (4)对步骤(3)所 得关联度进行排序， 评价特 征峰的抗炎活性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115184509 A 3