(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210853900.5 (22)申请日 2022.07.20 (71)申请人 湖北绿科乐 华生物科技有限公司 地址 438000 湖北省黄冈市团风县团风 镇 江宇路1号 (72)发明人 李双全　胡志琦　童志峰　何月　 韦优　 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种酵母培养物中甘露聚糖含量的测定方 法 (57)摘要 本发明公开了一种酵母培养物中甘露聚糖 含量的测定方法， 通过 以甘露聚糖为标准品， 用 处理样品的方法处理甘露聚糖， 步骤一致， 方法 一致， 无需转换系数， 测试结果更准确， 优于以甘 露糖作标准品， 可明确减小 误差， 其原理为： 同一 时刻进入色谱柱的各组分， 由于在流动相和固定 相之间溶解、 吸附、 渗透或离子交换等作用的不 同， 随流动相在色谱柱两相之间进行反复多次的 分配， 由于各组分在色谱柱中的移动速度不同， 经过一定长度的色谱柱后， 彼此分离开来， 按顺 序流出色谱柱， 进入信号检测器， 在记录仪上或 数据处理装置上显示出各组分的谱峰数值， 根据 保留时间对照定性， 根据峰面积计算样品中的甘 露聚糖含量。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115452965 A 2022.12.09 CN 115452965 A 1.甘露聚糖含量的测定， 包括以下步骤， 其特 征在于： S1： 标准溶液的制备； 准确称取100mg甘露聚糖于10mL离心管中,加入6mL浓盐酸， 于旋 涡混合器上混合2min， 充分混匀， 将离心管置于30℃恒温水浴锅中3h， 每间隔30min用旋涡 混合器振荡混合2min； 将溶液转入100mL锥形瓶中， 用约50mL超纯水洗涤试管数次， 并将洗 涤液全部转入锥形瓶中， 将锥形瓶置于高压蒸气灭菌锅中101℃水解3h； 水解液冷却至 室温 后， 用氢氧化钠溶液调节pH值为中性， 超 纯水定容至100mL； 取适量用中速定性滤纸过滤， 再 将过滤后的溶液用超纯水稀释 成20.0， 40.0， 60.0， 80.0， 100， 250.0 μg/mL的系列 标准工作 溶液； S2： 样液的制备； 准确称取0.5 ‑1.5g样品适量于10mL离心管中， 加入6mL浓盐酸， 于旋涡 混合器上混合2min， 使样品充分混匀， 将离心管置于30℃恒温水浴锅中3h， 每间隔30min用 旋涡混合器振 荡混合2min； 将全部样品溶液转入100mL锥形瓶中， 用约50mL超 纯水洗涤试管 数次， 并将洗涤液全部转入锥形瓶中， 将锥形瓶置于高压蒸气灭菌锅中101℃水解3h； 水解 液冷却至室温后， 用氢 氧化钠溶 液调节pH值 为中性， 定容至10 0mL； 取适量用中速 定性滤纸过 滤， 此为供 试品溶液； S3： 色谱条件； S4： 绘制标准曲线； S5： 样品的测定； S6： 结果计算。 2.根据权利要求1所述的甘露聚糖含量的测定， 其特征在于： 步骤1中微量进样器的容 积为100ul， 称重用的是仪器为分析天平， 且分析天平的精度为0.1mg。 3.根据权利要求1所述的甘露聚糖含量的测定， 其特征在于： 步骤2中标准工作溶液或 供试品溶液、 0.5mol/L  PMP甲醇溶液、 0.3mol/L  NaOH 溶液各 400 μL， 置于10mL具塞离心管 中， 充分混匀后于80℃水浴衍生化反应90min， 放冷， 加入0.3mol/L  HCL 溶液500 μL， 混匀， 用2mL三氯甲烷溶液洗涤并将水层液离心， 弃下层液体， 取上清液继续用2mL三氯甲烷溶液 洗涤并离心， 重复洗涤离心过程3 ‑4次， 最后一次上清液用0.45 μm滤膜过 滤， 待测。 4.根据权利要求1所述的甘露聚糖含量的测定， 其特征在于： 步骤3中C18  色谱柱的填 料粒径:5 μm； 柱尺寸:φ4.6mmx2 50mm 或分析效果相类似的其他色谱柱； 流动相： 0.02mol/L 乙酸铵一乙腈(80.0： 20.0)； 流速： 1.0mL/mi n； 柱温： 3 5℃； 检测波长： 25 0nm； 进样量： 20 μL。 5.根据权利要求1所述的甘 露聚糖含量的测定， 其特征在于： 在步骤4中， 将制备好的甘 露聚糖标准工作溶液系列分别进样后， 以标样浓度为横坐标， 峰面积为 纵坐标作标准曲线， 线性相关系数应为0.9 990以上。 6.根据权利要求1所述的甘 露聚糖含量的测定， 其特征在于： 在步骤5中， 将制备好的试 样进样， 根据标准品的保留时间定性样品中的甘露 聚糖的色谱峰， 根据样品的峰面积， 计算 甘露聚糖组分的含量。 7.根据权利要求1所述的甘露聚糖含量的测定， 其特征在于： 步骤6中根据公式： Y=T/W 来计算结果， 其中： Y:甘露聚糖在待测样品中含量(%)  ； T:甘露聚糖糖计算量(g)  ； W:称取 样品质量(g)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115452965 A 2一种酵母培养 物中甘露聚糖含量的测定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及甘露聚糖测定技术领域， 具体为一种酵母培养物中甘露聚糖含量的测 定方法。 背景技术 [0002]甘露聚糖是一种既经济又高效的天然食品防腐剂， 能有效地防止食品腐败变质、 发霉和遭受虫害， 是高度分支的多聚体， 广泛存在与多种生命形式中的物质， 性状为无色、 无毒、 无异味。 甘露 聚糖是酵母培养物的主要成分， 也是酵母培养物生产企业必需要检测的 成分之一。 目前对酵母培养物中甘露聚糖含量的测定主要采用 “柱前衍生高效液相包谱 法”， 该方法的主要步骤为： （1） 对酵母培养物进行预处理使其中的酵母细胞壁破壁； （2） 对 预处理后的样品在酸性条件下进行水解反应； （3） 样品水解反应后的溶液酸碱度调成中性 后， 与相应的衍生化试剂在一定条件下进行衍生化反应， 同时甘露糖标准溶液在相同条件 下进行衍生化反应； （4） 以甘露糖为标准品溶液， 衍生化后的样品和衍生化后的标准品溶液 经反相高效液相色谱进 行分析检测； （5） 根据得到的色谱 数据计算出样品中甘露糖的质量， 再换算成甘露 聚糖的含量。 在此方法中， 以甘露聚糖为标准， 需先对样品进行甘露糖含量的 测定后再通过换算才能得到甘露聚糖含量， 这无疑对后续测试结果造成影响， 影响结果的 准确性， 误差较大， 所以这里提出甘露聚糖含量的测定来 解决现有技 术的不足。 发明内容 [0003]本发明解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷， 提供一种酵母培养物中甘露聚 糖含量的测定方法。 [0004]为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 甘露聚糖含量的测定， 包括以下步 骤： S1： 标准溶液 的制备； 准确称取100mg甘露聚糖于10mL离心管中,加入6mL浓盐酸， 于旋涡混合器上混合2min， 充分混匀， 将离心管置于30℃恒温水浴锅中3h， 每间隔30min用 旋涡混合器振荡混合2min； 将溶液转入100mL锥形瓶中， 用约50mL超纯水洗涤试管数次， 并 将洗涤液全部转入锥形瓶中， 将锥形瓶置于高压蒸气灭菌锅中101℃水解3h； 水解液冷却至 室温后， 用氢氧化钠溶液调节pH值为中性， 超纯水定容至100mL； 取适量用中速定性滤纸过 滤， 再将过滤后的溶液用超纯水稀释成2 0.0， 40.0， 60.0， 80.0， 100， 250.0 μg/mL的系列标准 工作溶液； S2： 样液的制备； 准确称取0.5 ‑1.5g样品适量于10mL离心管中， 加入6mL浓盐酸， 于 旋涡混合器上混合2min， 使样品充分混匀， 将离心管置于30℃恒温水浴锅中3h， 每间隔 30min用旋涡混合器振荡混合2min； 将全部样品溶液转入100mL锥形瓶中， 用约50mL超纯水 洗涤试管数次， 并将 洗涤液全部转入锥形瓶中， 将锥形瓶置于高压蒸气灭菌锅中101℃水解 3h； 水解液冷却至室温后， 用氢氧化钠溶液调节pH值为中性， 定容至100 mL。 取适量用中速定 性滤纸过 滤， 此为供 试品溶液；说　明　书 1/5 页 3 CN 115452965 A 3