(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202211071036.X (22)申请日 2022.09.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 115144508 A (43)申请公布日 2022.10.04 (73)专利权人 广州市乾相生物科技有限公司 地址 510260 广东省广州市海珠区新港西 路135号大院中大蒲园区628栋中大科 技园A座自编号1510室 专利权人 态创生物科技 （广州） 有限公司 (72)发明人 王海梅　张志乾　王嘉鹏　吴奕瑞　 江翱　邱益　王帆　崔华　谭洪群　 (74)专利代理 机构 北京佰亦知识产权代理事务 所(普通合伙) 16097 专利代理师 陈柳叶(51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (56)对比文件 CN 107375 041 A,2017.1 1.24 CN 111679028 A,2020.09.18 CN 114047269 A,202 2.02.15 CN 1087141 11 A,2018.10.3 0 CN 105624247 A,2016.0 6.01 CN 110604704 A,2019.12.24 郭添 等.GHK及GHK- Cu纯化方法研究. 《广州 化工》 .2018,第46卷(第3期), 审查员 张钰 (54)发明名称 一种适用于多种水 溶性肽的HPLC分离方法 (57)摘要 本发明涉及一种适用于多种水溶性肽的 HPLC分离方法， 其特征在于： 第一步： 配制一个或 多个待测水溶性肽样品， 所述水溶性肽样品可以 是单一种水溶性肽或多种水溶性肽的混合物； 第 二步： 根据配制的待测水溶性肽样品的种类， 设 定液相色谱条件； 第三步： 配制分析用流动相； 第 四步： 色谱柱平衡化； 第五步： 采用分析程序对其 中一个待测水溶性肽样品进行测定： 第六步： 采 用流动相B清洗色谱柱1~5min； 第七步： 重复第五 步和第六步， 对其他未测的待测水溶性肽样品依 次进行测定。 本发明的适用于多种水溶性肽的 HPLC分离方法操作 简单， 连续分离测定多种水溶 性肽时， 节约大量的时间成本和经济成本， 大大 简化了操作的复杂性， 对多种水溶性肽具有普适 性。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115144508 B 2022.12.13 CN 115144508 B 1.一种适用于多种水 溶性肽的HPLC分离方法， 其特 征在于： 第一步： 配制多个待测水 溶性肽样品， 所述水 溶性肽样品是 单一种水 溶性肽； 第二步： 根据配制的待测水 溶性肽样品的种类， 设定液相色谱条件； 第三步： 配制分析用流动相； 第四步： 色谱柱 平衡化； 第五步： 采用分析程序对其中一个待测水 溶性肽样品进行测定； 第六步： 采用流动相B清洗色谱柱1~5min； 第七步： 重复第五步和第六步， 对其 他未测的待测水 溶性肽样品依次进行测定； 其中： 对于所述分析用流动相， 流动相A为超纯水， 流动相B为乙腈； 所述色谱柱为填料为C18 的色谱柱； 流速为0.3～5mL/mi n； 波长范围为210~230nm或260~280nm； 上述分析程序如下： 0.00～2.5min， 所述流动相A和所述 流动相B的比例为95％： 5％； 2.5～10mi n， 所述流动相A和所述 流动相B的比例为95.0～40.0％： 5.0～6 0.0％； 10～12.5mi n， 所述流动相A和所述 流动相B的比例为 40％： 60％； 12.5～12.6mi n， 所述流动相A和所述 流动相B的比例为 40~95％： 60~5％； 12.6～15mi n， 所述流动相A和所述 流动相B的比例为95.0％： 5.0％； 所述水溶性肽为寡肽 ‑1、 蓝铜胜肽、 二肽 ‑2、 四肽‑9、 乙酰基四肽 ‑9、 六肽‑9、 寡肽‑3和 乙酰基六肽 ‑8。 2.根据权利要求1所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 相对于每 100mL超纯水， 所述水 溶性肽样品的质量 为0.1~0.3g。 3.根据权利要求1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 相对 于每100mL超纯水， 所述水 溶性肽样品的质量 为0.1g。 4.根据权利要求1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 所述 流速为1 mL/min。 5.根据权利要求1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 色谱 柱柱温为室温， 进样量为10～30μL， 进样器温度为环境温度， 待测样品采集时间为10~ 30min。 6.根据权利要求5所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 所述进样 量为20 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115144508 B 2一种适用于多种水溶性肽的HPL C分离方法 技术领域 [0001]本发明属于分析化学领域， 具体涉及一种适用于多种水溶性肽的高效液相色谱法 (HPLC)分离方法。 背景技术 [0002]现有技术中， 对于肽类的HPLC分析方法已有很多报道， 然而， 在这些报道中， 多为 针对一种肽或者是接近结构的几种肽进行分离测定， 例如， 现有技术文件CN109870525A公 开了一种用液相色谱法分离测定多肽及其中杂肽的方法， 其采用磷酸盐作为峰形增强试剂 分离测定了多肽N端缺1个氨基酸的38肽、 多肽N端缺2个氨基酸的37肽。 现有技术中鲜有使 用一种通用的HPLC方法进 行三种以上多种水溶性肽的分离测定。 一般是每种肽 对应一个专 一的方法， 不仅使得流动相配制工作繁琐,而且所需试剂种类繁多， 无论从管 理上还是从所 需空间上都需要很大的投入。 例如： 肽1用的流动相是甲醇和水， 而用的分析程序是程序1， 用的色谱柱是硅胶柱， 分析时间为 15min； 而肽2用的流动相是乙腈和水， 而用的分析程序是 程序2， 用的色谱柱为十八烷基柱， 分析时间为15min。 当分析完肽1后切换成分析肽2时， 不 仅要对硅胶柱进行清洗， 然后换成十八烷基柱， 更要配制乙腈和水流动相， 再对十 八烷基柱 进行前期清洗， 而后再对其进行平衡， 这就需要花费大概2小时的时间。 然而分析时间其实 只需要15mi n， 这前后会造成大量的时间成本浪费。 [0003]此外， 根据现有技术文献报道： 不同的肽类使用不同的流动相， 如不同的乙腈或甲 醇与水的配比， 从而达到 分离的目的。 同时也有使用纯有机试剂或无机盐的相关报道。 但 这 些方法均只能满足一种肽或蛋白， 并不通用于大部分肽类或蛋白质类， 而且使用无机盐时 如果冲洗不彻底极易造成仪器或色谱柱堵塞,给后续工作带来困扰。 [0004]在以往的工作 中， 肽类分析时很容易出现几种肽不能完全分离 的情况， 而在分析 肽类含量时又要求必须完全分离， 否则无法准确计算肽的含量。 同时， 分析肽类时通常每种 肽对应一种方法， 包括分析程序， 流动相成分及配比。 使得操作步骤复杂繁琐。 [0005]另外， 现有技术的方法为了改善色谱峰峰形， 一般会在流动相 里添加酸类或者三 氟乙酸， 这样会导致最终产品中酸类或三氟乙酸有残留， 使产品呈现酸性并能闻到明显的 酸味， 而一些肽类实际在酸性条件下并不稳定， 影响其储存时间。 再者， 由于三氟乙酸是强 酸， 对色谱柱的耐受性有很高要求， 一般色谱柱无法承受强酸， 需采用强化型色谱柱。 [0006]因此， 亟待研究探寻一种更加通用的高效液相色谱法， 对更多种类的水溶性肽具 有普适性。 发明内容 [0007]发明要解决的问题 [0008]针对现有技术存在的问题， 本发明的目的之一是解决对多种水溶性肽样品进行 HPLC方法分离测 定时， 需要更换或清洗色谱柱、 更换流动相、 重新进行平衡等工序， 造成时 间成本上的浪费的问题。说　明　书 1/6 页 3 CN 115144508 B 3