(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210890638.1 (22)申请日 2022.07.27 (71)申请人 中山大学附属第一医院 地址 510000 广东省广州市中山 二路58号 (72)发明人 杨国奋　赖慧玲　何伟鹏　郭云云　 孙婷婷　李媛媛　田黎明　吴琳祥　 张祖威　 (74)专利代理 机构 南京新众合专利代理事务所 (普通合伙) 32534 专利代理师 彭雄 (51)Int.Cl. G01N 33/574(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (54)发明名称 一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤 标志物的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种血清细胞外囊泡中上皮 性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法， 1、 包括以下步 骤： 步骤一： 选择一组健康对照者、 一组卵巢囊腺 瘤患者和一组上皮性卵巢癌患者。 本研究中关于 卵巢癌血清细胞外囊泡的蛋白组学研究， 提出了 血清细胞外囊泡中的蛋白质分子FGA,FGB,FGG, FGL1,APOL1,APOA4,ITIH3,MUC16可作为卵巢癌 诊断的分子标志物， 并通过PRM进行了验证， 此 外， 研究中基于血清细胞外囊泡蛋白组学结果建 立的卵巢癌诊断模型在全部以及早期的卵巢癌 病人中都表现出较好的诊断效能， 可对临床上现 有的卵巢癌诊断措施进行补 充， 提供一个新的卵 巢癌诊断思路和策略， 能够帮助实现卵巢癌的早 期诊断， 从而改善患者 生存和预后。 权利要求书3页 说明书9页 附图14页 CN 115166248 A 2022.10.11 CN 115166248 A 1.一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 步骤一： 选择一组健康对照者、 一组卵巢囊腺瘤患者和一组上皮性卵巢癌 患者； 步骤二： 对患者和健康对照者提取血清样品， 从患者血清中分离提取细胞外囊泡后利 用TEM、 NTA、 WB和生物信息学分析对其进行鉴定； 步骤三： 通过LC ‑MS/MS分析， 鉴定出所有的可定量 蛋白质， 并筛选出组间的差异表达蛋 白， 并通过PRM验证， ROC分析 得出可作为卵巢癌诊断标志 物的蛋白标记 物； 步骤四： 进行单因素和多因素logistic回归分析， 对蛋白标记物建立诊断模型， 回归方 程为LogitP＝2.481*FG G+8.970*MUC16–1.709*APOA4 ‑0.184， 并判断是否具有 诊断效能。 2.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方 法， 其特征在于： 所述卵巢肿瘤患者为进 行过卵巢肿瘤手术且有术后病理结果的患者， 所述 卵巢肿瘤患者在血液采集前未接受其他治疗， 所述卵巢肿瘤患者没有其他器官或部位肿瘤 病变， 所述卵巢肿瘤患者没有其 他血液疾病、 感染性疾病 、 内分泌疾病 、 免疫或代谢性疾病。 3.根据权利要求2所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方 法， 其特征在于： 所述血清样品均于患者入院后在空腹状态下采集， 首先采集血液样本于 BDvacutainer血清管中， 室温下， 血液静置凝固1到2小时， 然后4℃冰箱过 夜使血块固缩， 血 清析出， 随后将析出的血清4℃， 3000g离心10分钟， 离心后的上清转移至新的Eppen dorf离 心管中， 分装保存于 ‑80℃冰箱。 4.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方 法， 其特征在于： 所述细胞外囊泡提取时， 血清样品从－80℃冰箱取出， 冰上融化， 在4℃， 12000g离心10 ‑15分钟， 离心后将上清液转移至新的离心管， 0.22 μM微孔滤膜过滤后用细胞 外囊泡提取试剂盒 qEVoriginalSiz eExclusionColumn去分离提取细胞外囊泡， 具体步骤如 下， 首先将分离柱放置在支架上， 使其垂直， 盖好底部的luer ‑slipcap， 然后取下盖子， 打破 真空密封， 取下luer ‑slipcap， 用至少10mlPBS洗脱缓冲液冲洗柱子， 盖上luer ‑slipcap， 用 移液器移去顶部的缓冲液， 用移液器向分离柱中加 入500 μl血清样品， 取下luer ‑slipcap， 开始收集分离过滤后的样本， 最开始的3ml是空隙体积， 继续向分离柱中添加PBS以洗脱囊 泡， 最后收集空隙体积后的0.5ml液体为高纯度细胞外囊泡。 5.根据权利要求4所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方 法， 其特征在于： 所述NTA分析中， 细胞外囊泡用PBS重悬， 使用NanosightNS300对重悬液体 中纳米颗粒 的布朗运动进行实时动态跟踪， 观察并获得相应的粒径分布及浓度信息， 所述 TEM分析中， 使用透射电子显微镜， 首先用PBS重悬试剂盒提取的细胞外囊泡， 吸取5 ‑10 μl重 悬的待观察细胞外囊泡样本滴加于电镜的专用的铜网上， 室温下放置进行沉淀1～2分钟， 并用滤纸吸去浮液， 先用PBS进行漂洗， 然后吸取磷钨酸5 ‑10 μl滴加 于铜网上， 沉淀并进行 负染色1‑2分钟， 用滤纸 吸去浮液， 常温下干燥2分钟， 上机成像， 电镜下观察并记录细胞外 囊泡的形态特 征。 6.根据权利要求4所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方 法， 其特征在于： 所述WB分析中， 首先提取细胞外囊泡蛋白质， 细胞外囊泡提取后放置于－ 80℃冰箱保存， 使用时从冰箱取出， 冰上溶解， 避免反复冻融， 向细胞外囊泡溶液中加入已 配制好的RIPA蛋白裂解液， 冰上裂解10 ‑15分钟， 使细胞外囊泡蛋白质裂解；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115166248 A 2然后测定蛋白浓度， 配制BCA的工作液： 按照50:1的比例将BCA蛋白浓度检测试剂盒中 的A液和B液混合后配制成BCA工作液， 室温放置备用， 按照每个反应孔200 μl工作液准备， 取 一个96孔板， 根据实验需求设置好标准蛋白孔和待测样品孔， 将BCA工作液加入到96孔板 中， 每孔200 μl， BCA蛋 白浓度测定试剂盒提供的标准的蛋 白液浓度为2mg/ml， 用ddH2O稀释 试剂盒中的标准蛋白液， 配制成梯度蛋白， 浓度分别为2000μg/ml， 1000μg/ml， 500μg/ml， 250 μg/ml， 12 5 μg/ml， 0 μg/ml， 待测蛋白样品用ddH2O稀释10倍， 向每孔中加入2 0 μl的梯度蛋 白液和稀释后的待测蛋白样品， 混匀， 37℃避光孵育30 分钟， 测定562nm波长下的吸光度， 用 标准蛋白品的浓度和吸光度OD 562值绘制标准曲线， 计算浓度公 式， 根据公 式计算出待测蛋 白样品的浓度； 蛋白变性， 将测好浓度的蛋白用ddH2O进行稀释， 根据WB每孔50 μg/20 μl的上样量， 计算 所要加入的ddH2O和4 ×蛋白上样缓冲液， 进而配制WB的上样体系， 然后将配制好的WB上样 体系混匀后放入100℃金属浴， 加热变性10分钟， 取出后立即将蛋白样品置于冰上或者于 ‑ 20℃冰箱冻存备用； SDS‑PAGE凝胶电泳， 选择玻璃板， 流水冲洗， 洗涤剂洗刷， 洗净玻璃板表面的污渍和颗 粒物， 室温晾干或烤箱烘干， 将玻璃板安装在制胶架上， 据待测蛋白样品的分子量大小选择 合适的浓度， 中等分子量选择10％SDS ‑PAGE， 小分子量选择12％SDS ‑PAGE， 大分子量选择 8％SDS‑PAGE， 分离胶配制完成后， 混匀， 加入玻璃板中至距离顶端2cm处， 检查有无渗漏， 若 无渗漏加入异丙醇压平， 室温静置30 分钟， 分离胶静置30 分钟无漏胶且凝固后， 弃去玻璃板 间异丙醇， 按配方配制浓缩胶， 混匀后加在分离胶的上面， 然后选择梳子， 向浓缩胶内垂直 插入， 注意梳齿之 间不能产生气泡， 室温静置20 分钟， 待浓缩胶完全凝固后， 制胶完成， 取出 备用， 蛋白上样： 将配制好的电泳胶放置于电泳槽中， 预先配制好 10x电泳缓冲液， 电泳时用 ddH2O稀释成1x电泳缓冲液， 向槽中加入1x电泳缓冲液， 在缓冲液中垂直 向上拔去梳子， 然 后用加样枪按照一定顺序向各孔中加入蛋白样品和预染的蛋白mar ker， 电泳： 打开电源， 先 用80V电压恒压电泳30分钟， 当蛋白marker到达分离胶且条带分离清可辨时， 调整电压为 120V继续恒压电泳直至目的蛋白电泳 到合适位置， 关闭电源， 结束电泳； 恒流湿转， 材料准备： 0.45μm的PVDF转印膜切成和蛋白胶块相当的大小， 大小为6.5 ± 0.1cmx8±0.1cm， 同时裁剪相应大小的滤纸， PVDF膜浸泡于甲醇中激活， 取10x转膜缓冲液 100ml， 加入200ml甲醇， 700mlddH2O， 混匀配制成1x转膜缓冲液， 预冷备用， 取出电泳后的玻 璃板， 撬开， 沿着分离胶边界切去 上层胶， 取出分离胶， 放在预先配制好的1x转膜缓冲液中， 将转膜用的塑料夹打开， 海绵垫和滤纸依次叠放在夹子上， 黑色面夹子滤纸上放电泳胶， 白 色面夹子上放活化后的PVDF膜， 按照三明治顺序叠放， 随后赶走PVDF膜与分离胶之间的气 泡， 将夹紧后的塑料夹放到转膜槽中， 槽内加入预冷的1x转膜缓冲液， 同时放入冷冻的冰 板， 将转膜槽整体放入冰盒 中并加满冰， 接好电源， 300 mA恒流转膜， 根据分子量大