(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210950069.5 (22)申请日 2022.08.09 (71)申请人 苏州和合医学检验 有限公司 地址 215000 江苏省苏州市昆山市玉山 镇 元丰路168号3号房 (72)发明人 贾继明　王贯宇　陆超瑾　黄文君　 周瑶　陆晓春　 (74)专利代理 机构 天津垠坤知识产权代理有限 公司 12248 专利代理师 江洁　王忠玮 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种血清中叶酸和5-甲基四氢叶酸的血药 浓度测定方法 (57)摘要 本发明涉及血药浓度测定方法技术领域， 且 公开了血清中叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸的血药浓 度测定方法， 包括以下步骤， 样本的采用， 采用 2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5 ‑甲 基四氢叶酸标品进行混合， 高度模拟临床真实样 本。 该血清中叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸的血药浓度 测定方法， 通过建立一种快速、 准确、 灵敏度高的 液质联用方法， 用于测定患者血清中叶酸和5 ‑甲 基四氢叶酸的血药浓度， 采用2％小牛血清白蛋 白生理盐水溶液与叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸标品 进行混合， 高度模拟临床真实样本， LC ‑MS/MS法 具有色谱的高分离度， 同时还具有质谱的高选择 性、 高灵敏度， 二者有效结合进行叶酸和5 ‑甲基 四氢叶酸的快速、 准确定量。 权利要求书5页 说明书14页 CN 115326957 A 2022.11.11 CN 115326957 A 1.血清中叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸的血 药浓度测定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 样本的采用 采用2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸标品进行混合， 高度 模拟临床真实样本； S2、 性能参数 检测限(LOD)： 叶酸： 1ng/mL； 5‑甲基四氢叶酸： 1ng/mL； 测定低限(LOQ)： 叶酸： 2ng/mL； 5‑甲基四氢叶酸： 2ng/mL； 线性范围： 叶酸： 2ng/mL ‑100ng/mL； 5‑甲基四氢叶酸： 2ng/mL ‑100ng/mL； 方法验证时， 回收率和精密度的要求： 回收率为85 ％‑115％， 精密度(日内精密度、 日间 精密度、 仪器精密度)为RS D<15％； 稳定性： (储备液长期稳定性、 模拟样品处置前室温放置4h稳定性、 模拟样品处置后4℃ 放置24h稳定性、 模拟 样品反复冻融3次稳定性、 模拟 样品‑80℃长期存放稳定性)； S3、 原始样本系统 样本类型为血清， 其样本采集通过采血针采集静脉全血， 全血离心(3500r/min， 10min)， 取上清即得 血清， 样本保存在 ‑80℃保存容器中； S4、 空白血清的来源 因叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸是内源性物质， 本实验采取用替代基质来做标准曲线和质控 样品， 替代基质为2％小牛 血清白蛋白的生理盐水 溶液， 生理盐水为自己配制的； S5、 所需试剂 S5.1、 水： 超纯 水， 由实验室Po ll超纯水仪所制； 乙腈、 甲醇、 乙醇、 甲酸、 25mo l/L氢氧化钠： 质谱级， Fisher公司； 溶液如下： 流动相： 0.0 5％甲酸水 溶液(A)—乙腈(B)； S5.2、 标准品与各种溶 液 所用溶液的配制： 精密称取叶酸标品2.822mg， 乘以纯度系数92.3％， 用5％NaOH (0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的叶酸储备液， 于 ‑20℃冰箱中保存备 用， 精密称取5 ‑甲基四氢叶酸钙标品2.2 60mg， 除以校正因子后， 用5％NaOH(0.1mol/L)20％ 乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的5 ‑甲基四氢叶酸储备 液， 于‑20℃冰箱中保存备用； 内标母液与工作液的配制： 精密称取甲氨喋呤标品2.147mg， 用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为 0.5mg/mL的 甲氨喋呤储备 液， 于‑20℃冰箱中保存备用； 精密移取上述配制 好的甲氨喋呤母液0.02mL， 置于1.5mL离心管中， 加入0.98mL甲醇： 水(1:1； v: v)稀释， 混匀， 得浓度为10000ng/mL的甲氨喋呤内标溶液1； 再次精密移取0.01mL 甲氨喋呤内标溶液1， 置于1.5mL离心管中， 加入0.99mL甲醇： 水(1:1； v:v)稀释， 混匀， 得浓 度为100ng/mL的 甲氨喋呤内标 溶液2； 内标工作液即沉淀剂， 为甲氨喋呤浓度为2ng/mL的 甲醇溶液(0.1mg/mL  VC)；权　利　要　求　书 1/5 页 2 CN 115326957 A 2取10 μL维生素C储备液， 20 μL甲氨喋呤内标溶液2(100ng/mL)加入到970 μL的甲醇中， 即 沉淀剂； 维生素C溶 液的配制： 精密称取一定量的维生素C， 用超纯水配制成浓度为10mg/mL维生素C储备液， 于 ‑20℃ 冰箱中保存 备用， 取10 μL维生素C储 备液， 加入到990 μL的水中， 涡旋得到0.1mg/mL的维生素 C工作液； 9％氯化钠水 溶液的配制： 精密称取一定量的氯化钠， 用超纯水配制成浓度为0.9％氯化钠水溶液， 于4℃冰箱中 保存备用； 标准曲线工作稀释液和复溶 液(10％乙腈水(含0.1mg/mL  VC)： 取10μL维生素C储备液， 100μL纯乙腈， 加入到890μL的水中， 涡旋得到标准曲线工作稀 释液和复溶 液； S5.3、 质控样品工作溶 液的配制 分别精密移取配制好的叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸母液0.02mL至1.5mL离心管中， 加入 0.96mL的10％乙腈水溶液(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释， 得浓度为10000ng/mL的混合质控 工作液1； HQC工作液： 精密移取配制好的， 质控工作液1， 0.160mL至1.5mL离心管中， 加入0.840mL 的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释， 得浓度为1600ng/mL的混合质控工作液2， 此 溶液为高浓度质控工作液； MQC工作液： 精密移取配制好的质控工作液2， 0.5mL至1.5mL离心管中， 加入0.5mL的 10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释， 得浓度为800ng/mL的混合质控工作液3， 此溶液 为中浓度质控工作液； 精密移取配制好的质控工作液3， 0.5mL至1.5mL离心管中， 加入0.5mL的10％乙腈水(VC 浓度为0.1mg/mL)进行稀释， 得浓度为 400ng/mL的混合质控工作液4； LQC工作液： 精密移取配制好的质控工作液4， 0.3mL至1.5mL离心管中， 加入0.7mL的 10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释， 得浓度为120ng/mL的混合质控工作液5， 此溶液 为低浓度质控工作液； 上述配制好的质控工作液均于 ‑20℃冰箱中保存备用； S6、 标准曲线工作液的配制 精密移取上述配制好的叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸0.02mL， 置于1.5mL离心管中， 加入 0.960mL标准曲线稀释液稀释， 涡旋混匀， 得浓度为10 000ng/mL的混合工作液1； 标准曲线L1点： 精密移取0.2 mL配制好的工作液1， 置于1.5mL离心管中， 加入0.8mL10％ 乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释， 涡旋混匀， 得浓度为20 00ng/mL的混合工作液2； 标准曲线L2点： 精密移取0.5mL配制好的工作2， 置于1.5mL离心管中， 加入0.5mL10％乙 腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释， 涡旋混匀， 得浓度为10 00ng/mL的混合工作液3； 标准曲线L3点： 精密移取0.4mL配制好的工作 3， 置于1.5mL离心管中， 加入0.6mL10％乙 腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释， 涡旋混匀， 得浓度为 400ng/mL的混合工作液4； 标准曲线L4点： 精密移取0.5mL配制好的工作4， 置于1.5mL离心管中， 加入0.5mL10％乙 腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释， 涡旋混匀， 得浓度为20 0ng/mL的混合工作液5；权　利　要　求　书 2/5 页 3 CN 115326957 A 3