(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210895724.1 (22)申请日 2022.07.27 (71)申请人 广东太稳生物工程有限公司 地址 519000 广东省珠海市横琴新区荣珠 道191号25 栋2507-01房 申请人 华中科技大 学同济医学院附属同济 医院 (72)发明人 孙培龙　吴俊芳　刘程　汪道文　 许琳　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 姜磊 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/34(2006.01)G01N 30/60(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种血清中25羟基维生素D的检测方法 (57)摘要 本发明属于化学检测技术领域， 公开了一种 血清中25羟基维生素D的检测方法。 所述检测方 法采用液相色谱串联质谱进行检测， 所述液相色 谱的条件包括： 色谱柱为UPLC  ACQUITYTM HSS  PFP column； 流动相A为0.1％ ‑0.5％甲酸水溶 液， 流动相B为甲醇。 该方法特异性强、 准确度高， 适用于各年龄段人群血清样 本中25羟基维生素D 的检测。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115356408 A 2022.11.18 CN 115356408 A 1.一种血清中25羟基维生素D的检测方法， 其特征在于， 采用液相色谱串联质谱进行检 测， 所述液相色谱的条件包括： 色谱柱为UPLC  ACQUITYTM HSS PFP column； 流动相A为 0.1％‑0.5％甲酸水 溶液， 流动相B为甲醇。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述色谱柱的尺寸为2.1mm ×50mm， 1.8 μm。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述液相色谱 采用梯度洗脱的方式。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特 征在于， 所述梯度洗脱的条件为： 0‑4min， 流动相B的体积分数由70％变化至95％； 4‑4.01min， 流动相B的体积分数由95％变化至70％； 4.01‑4.5min， 流动相B的体积分数为70％。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述液相色谱的条件还包括： 流速为 0.4mL/mi n； 柱温为 40℃； 进样量 为2‑10 μL。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述质谱的条件包括： ESI源正离子模 式， 多反应监测扫描模 式； 喷雾电压： 1.5 ‑2.5kV； 去溶剂温度： 450 ‑550℃； 雾化器流速800 ‑ 1000L/h； 离子源温度： 120 ‑150℃； 锥孔气流速： 5 5‑65L/hr。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述质谱的检测参数如下 所示： 目标分析物 Q1(Da) Q3(Da) CV(V) CE(V) 25‑OH VD2 413.3 113.1 20 10 25‑OH VD3 383.3 257.2 20 15 25‑OH VD2_IS 416.4 113.1 20 10 25‑OH VD3_IS 386.3 257.2 20 15 8.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法还 包括： 以BSA为基质， 配制含不同浓度梯度目标物的校准品溶液， 加入同位素标记物进行预处 理后， 用LC ‑MS/MS检测； 以校准品溶液中目标物的浓度为X轴， 以校准品溶液中目标物与其 对应同位素 标记物的峰面积比为Y轴， 绘制得到标准工作曲线； 在待测血清样本中加入同位素标记物， 进行预处理后用LC ‑MS/MS检测， 并根据标准工 作曲线得 出待测血清样本中25羟基维生素D的含量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115356408 A 2一种血清中25羟基维生素D的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于化学检测技 术领域， 尤其涉及一种血清中25羟基维生素D的检测方法。 背景技术 [0002]维生素D(以下称VD)是一种脂溶性类固醇衍生物， 是人体必需的维生素， 主要包括 VD2和VD3两种形式。 人体内的VD可以通过阳光照射转化或从食物中摄取， 例如贮存于皮下 的7‑脱氢胆固醇经阳光中紫外线照射后可转化为VD3， 而VD2可以通过食物进行补充。 人体 内的VD2和VD3 经肝脏会代谢为2 5‑OH VD2和25‑OH VD3， 血液中2 5‑OH VD2和25‑OH VD3浓度 高， 是体内VD的主要存在形式， 且稳定好， 体内循环半衰期约为2 ‑3周， 因此血液中的25 ‑OH  VD2和25‑OH VD3成为公认的评价人体VD营养状态的最可靠指标。 [0003]然而， 在人体中还存在25 ‑OH VD3的差向异构 体——3‑epi 25‑OH VD3， 约占总25 ‑ OH VD的4％， 其在成人体内含量较低， 但在新生儿体内浓度极高， 约占25 ‑OH VD总浓度的 60％。 3‑epi 25‑OH VD3不具有生物活性， 在检测时若不能有效分离该物质， 将造成25 ‑OH  VD3的检测结果偏高的误差 。 [0004]传统的维生素D检测方法有放射免疫法、 竞争蛋白结合法、 高效液相色谱法等， 其 中放射免疫法、 竞争蛋白结合法存在前处理复杂、 分析时间长、 通量低、 方法特异性差的缺 点， 且不能同时准确定量25 ‑OH VD2和25‑OH VD3的含量。 目前国际普遍认为LC ‑MS/MS是检 测血清中25羟基维生素D的 “金标准”， 然而当前所用方法仍未能对差向异构体进行有效的 分离， 检测结果存在偏差 。 [0005]因此， 本发明希望建立一种操作简便、 特异性高、 灵敏度好的用于检测人血清中25 羟基维生素D的方法。 发明内容 [0006]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种血清中25羟基维生素D的检测方法， 该检测方法特异性强、 准确度高， 适用于各年龄段人 群血清样本中25羟基维生素D的检测。 [0007]本发明提供了一种血清中25羟基维生素D的检测方法， 采用液相色谱串联质谱 (LC‑MS/MS)进行检测， 所述液相色谱的条件包括： 色谱柱为UPLC  ACQUITYTM HSS PFP  column； 流动相A为0.1％ ‑0.5％甲酸水 溶液， 流动相B为甲醇。 [0008]本发明提出， 以上述流动相体系结合特定的色谱柱类型， 可以实现25 ‑OH VD2、 25‑ OH VD3和3‑epi 25‑OH VD3的有效分离， 从而提高血清中25羟基维生素D的检测准确性。 [0009]优选地， 所述色谱柱的尺寸 为2.1mm×50mm,1.8 μm。 [0010]优选地， 所述液相色谱 采用梯度洗脱的方式。 [0011]更优选地， 所述梯度洗脱的条件为： [0012]0‑4min， 流动相B的体积分数由70％变化至95％； [0013]4‑4.01min， 流动相B的体积分数由95％变化至70％；说　明　书 1/5 页 3 CN 115356408 A 3