(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210986443.7 (22)申请日 2022.08.17 (71)申请人 武汉食品化妆品检验所 地址 430000 湖北省武汉市东西湖区金山 大道1137号 (72)发明人 杨明　江小明　杨永　涂凤琴　 伊鋆　卢跃鹏　 (74)专利代理 机构 武汉科皓知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 42222 专利代理师 彭育 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种蜂蜜中硝基呋喃代谢物残留的快速测 定方法 (57)摘要 本发明涉及一种蜂蜜中硝基呋喃代谢物残 留的快速测定方法。本发明中以超声波辅助衍生 结合改进的QuEChERS技术与高效液相色谱 ‑串联 质谱法用于分析测定蜂蜜样品中的硝基呋喃代 谢物残留。 该测定方法具体为： 样品衍生、 提取净 化、 配置标准储备溶液和混合标准中间溶液、 基 质匹配工作溶液， 利用基质匹配标准工作溶液， 采用高效液相色谱 ‑串联质谱法进行测定， 绘制 标准曲线， 将待测溶液按照相同的仪器参数进行 检测， 获得试样中4种硝基呋喃代谢物的质量色 谱图， 然后进行定性定量分析。 本发明提供的快 速检测方法具有前处理操作简单、 净化效果好、 检测效率高、 灵敏度好和准确性高的优点。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115452972 A 2022.12.09 CN 115452972 A 1.一种蜂蜜中硝基呋喃代谢物 残留的快速测定方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)混合外标标准储备液和混合外标工作液的配制： 称取硝基呋喃代谢物混合外标标准 品， 用乙腈溶解并定容成浓度为100 μg/mL的外标标准储备液， 于 ‑20℃避光保存； 移取适量 混合外标 标准储备 液， 用乙腈稀释成浓度为10 0ng/mL的混合外标工作液； 2)混合内标工作液的配制： 将100 μg/mL的AOZ ‑D4、 AMOZ‑D5、 SEM‑13C15N2、 AHD‑13C3混合内 标标准品溶解在10mL乙腈中， 配制成浓度为 10 μg/mL的硝基呋喃代谢物的混合内标储 备液； 移取适量混合内标储备 液， 用乙腈稀释成浓度为10 0ng/mL的混合内标工作液； 3)基质匹配工作液的配制： 向不含待测物的蜂蜜样品中添加适量混合外标工作液和混 合内标工作 液， 经过前处理步骤， 得到浓度分别为0.25ng/mL、 0.5ng/mL、 1.0ng/mL、 2.0ng/ mL、 4.0ng/mL、 10ng/mL、 20ng/mL的系列基质匹配工作液； 4)样品前处理、 净化： 称取蜂蜜， 加入邻硝基苯甲醛、 盐酸溶液， 涡旋使其充分混匀， 于 超声波清洗仪中衍生， 衍生完全后再加入提取液， 涡旋提取、 离心， 取全部上清液用200mg   PSA+100mgC18进行QuEChERS净化， 涡旋提取、 离心后经0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤， 待分 析； 5)样品分析检测： 采用高效液相色谱 ‑串联谱法对系列基质匹配标准工作液进行测定， 绘制标准曲线； 以相同参数对步骤4)中上清液进行检测， 获得试样 中硝基呋喃代谢物的质 量色谱图， 以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析， 以内标法定量计算得到待测物 的浓度； 其中， 高效液相色谱 ‑串联谱法中流动相A为甲酸 ‑乙酸铵的水溶液， 水溶液中甲酸浓度 为0.1％(v/v)， 乙酸铵浓度为5mmol/L， 流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液； 线性梯度洗脱 中流 动相A+流动相B＝100％， 线 性梯度洗脱条件为： 0 ‑2min， 10.0％B； 2 ‑5.5min， 10.0 ‑90.0％B； 5.5‑8min， 90.0％B； 8 ‑8.1min， 90.0‑10.0％； 8.1 ‑10min， 10.0％B。 2.根据权利要求1所述的快速测定方法， 其特征在于， 步骤4)中样品前处理、 净化方法 为： 称取蜂蜜试样4g， 置于50mL离心管中， 添加适量混合内标工作液， 再添加0.2mL、 0.1mol/ L邻硝基苯甲醛及5mL、 0.2mol/L盐酸， 涡旋混合至完全溶解， 在53Hz、 60℃条件下水浴超声 波中衍生60min， 用3.0mL、 0.3mol/L  K3PO4溶液调pH至7.0 ±0.2后添加8.0mL乙腈和4.0g氯 化钠， 在剧烈旋转10min后以3900rpm的转速离心3min， 取全部上清液于含有200mg  PSA+ 100mg C18的10mL离心管中， 旋转混合物3min， 再在3900rp m下离心3min后通过0.22 μm聚四 氟乙烯滤膜过 滤， 待分析。 3.根据权利要求1所述的快速测定方法， 其特征在于， 步骤5)中标准曲线绘制方法为： 以高效液相色谱 ‑串联谱法对浓度分别为0.25ng/mL、 0.5ng/mL、 1.0ng/mL、 2.0ng/mL、 4.0ng/mL、 10ng/mL、 20ng/mL的系列基质匹配工作液进行检测， 获得基质匹配工作液的质量 色谱图， 以内、 外标的峰面积比为 纵坐标， 以内、 外标标准液的浓度比为横坐标， 绘制标准曲 线， 得到线性回归方程。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的快速测定方法， 其特征在于， 质谱条件为： 离子源为 电喷雾离子源； 检测方式为多反应监测； 扫描方式为正离子模式扫描； 幕气气 压为10psi； 离 子源气体为GS1、 50p si； 离子源气体为GS2、 50psi； 离子喷射电压为5500V； 源温度为500℃； 碰撞气体为氮气。 5.根据权利要求1 ‑3任一项所述的快速测定方法， 其特征在于， 色谱条件为： 色谱柱为权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115452972 A 2Waters XBridge C18柱； 进样体积为5 μL； 柱温为 40℃； 流速为0.3mL/mi n。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115452972 A 3