(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210918484.2 (22)申请日 2022.08.01 (71)申请人 中国科学院高能物理研究所 地址 100049 北京市石景山区玉泉路19号 乙 申请人 北京大学　国家纳米科 学中心 (72)发明人 王黎明　王静　白满诺夫·迪达尔　 陈春英　赵宇亮　周云龙　丛亚林　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 商秀玲 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 27/62(2021.01)G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位 鉴定与定量方法 (57)摘要 本发明涉及分析检测技术领域， 具体涉及一 种纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与 定量方法。 本发明的方法包括： 将待测纳米颗粒 固定于生物传感器表面， 将固定于生物传感器表 面的待测纳米颗粒置于生物样品溶液中进行孵 育， 采用生物膜干涉技术监测纳米颗粒表面蛋白 冠的形成； 待蛋白冠形成后， 以洗脱液分别洗脱 纳米颗粒表 面的软蛋白冠和硬蛋白冠； 采用质谱 技术对蛋白冠成分进行鉴定。 该方法可实现纳米 颗粒表面形成的多层蛋白冠在时间和空间上的 可控检测和鉴定， 特别是在软蛋白冠的实时动态 和准确分析方面具有广阔的应用前景， 为进一步 探究纳米颗粒与生物体的相互作用以及功能纳 米药物的合理设计提供了有效方法。 权利要求书1页 说明书11页 附图7页 CN 115453124 A 2022.12.09 CN 115453124 A 1.一种检测纳米颗粒与蛋白质相互作用的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 将待测纳 米颗粒固定于生物传感器表面， 将固定于生物传感器表面的待测纳米颗粒置于待测蛋白质 溶液中进行孵 育， 采用生物 膜干涉技 术检测纳米颗粒与蛋白质的结合。 2.根据权利要求1所述的检测纳米颗粒与蛋白质 相互作用的方法， 其特征在于， 所述固 定的方法为先在生物传感器表面进行免疫球蛋白修饰， 然后以封闭液对经免疫球蛋白修饰 的生物传感器表面进行封闭处 理后， 再与纳米颗粒共孵 育。 3.根据权利要求2所述的检测纳米颗粒与蛋白质 相互作用的方法， 其特征在于， 所述免 疫球蛋白为 IgG、 IgM或IgA； 和/或， 所述封闭液为包含如下组分的磷酸盐缓冲液： 0.03 ‑0.08％吐温 ‑20， 0.03‑0.08％聚乙 二醇； 优选地， 所述封闭液的pH为7.2 ‑7.5。 4.根据权利要求1～3任一项所述的检测纳米颗粒与蛋白质相互作用的方法， 其特征在 于， 所述待测蛋白质溶 液中， 待测蛋白质的浓度为0.1 ‑10mg/mL， pH为0.5 ‑9。 5.一种纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量方法， 其特征在于， 所述方法 包括： 将待测纳米颗粒固定于生物传感器表面， 将 固定于生物传感器表面的待测纳米颗粒 置于生物样品溶液中进行孵育， 采用生物膜干涉技术监测纳米颗粒表面蛋白冠 的形成； 待 蛋白冠形成后， 以洗脱液分别洗脱纳米颗粒表面的软蛋白冠和硬蛋白冠； 采用质谱技术对 蛋白冠成分进行鉴定 。 6.根据权利要求5所述的纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量方法， 其特 征在于， 所述固定的方法为先在生物传感器表面进行免疫球蛋白修饰， 然后以封闭液对经 免疫球蛋白修饰的生物传感器表面进行封闭处 理后， 再与纳米颗粒共孵 育。 7.根据权利要求6所述的纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量方法， 其特 征在于， 所述免疫球蛋白为 IgG、 IgM或IgA； 和/或， 所述封闭液为包含如下组分的磷酸盐缓冲液： 0.03 ‑0.08％吐温 ‑20， 0.03‑0.08％聚乙 二醇； 优选地， 所述封闭液的pH为7.2 ‑7.5。 8.根据权利要求5～7任一项所述的纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量 方法， 其特征在于， 所述洗脱液为包含如下组分中的一种或多种的水溶液： 十二烷基硫酸 钠、 氢氧化钠、 三氟乙酸、 甲酸、 乙酸、 盐酸、 氯化钠、 氯化镁； 优选地， 用于洗脱软蛋白冠的洗脱液为0.001 ‑0.05％的三氟乙酸水溶液， 和/或， 用于 洗脱硬蛋白冠的洗脱液为0.1 ‑1％的三氟乙酸水 溶液。 9.根据权利要求5～8任一项所述的纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量 方法， 其特 征在于， 所述 生物样品溶 液中， 总蛋白质的浓度为0.1 ‑10mg/mL， pH为0.5 ‑9。 10.根据权利要求5～9任一项所述的纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量 方法， 其特征在于， 所述方法还包括： 在采用质谱技术对蛋白冠成分进行鉴定后， 采用权利 要求1～4任一项所述的检测纳米颗粒与蛋白质相互作用的方法检测硬蛋白冠成分与纳米 颗粒之间的亲和力和/或硬蛋白冠与软蛋白冠成分之间的亲和力。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115453124 A 2一种纳米颗粒表面多层蛋白冠成分的原位鉴定与定量方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分析检测技术领域， 具体涉及 一种关于纳米颗粒表面多层蛋白冠成分 的原位鉴定与定量方法。 背景技术 [0002]近年来， 纳米颗粒由于独特的理化性质在生物医学领域展现了良好的应用前景。 纳米颗粒进入生物体后， 不可避免地会与各种生物体液接触。 在此过程中， 纳米颗粒表面会 吸附不同种类的蛋白， 在其表面形成 “蛋白冠”。 这些蛋白冠可能会改变纳米颗粒原始的表 面性质， 从而影响随后纳米颗粒与生物体的相互作用。 蛋白冠的形成可能影响纳米药物的 血液循环时间、 靶向性、 生物分布、 免疫反应、 毒性等。 因此为了更深入和全面地了解纳米颗 粒/纳米药物参与的生物学过程及其产生的生物效应， 蛋白冠的组成、 结构和功能的研究至 关重要。 [0003]具有高亲和力和慢解离速率的蛋白会在纳 米颗粒表面形成 “硬蛋白冠 ”， 而具有低 亲和力和快解离速率的蛋白则在纳米颗粒表面形成 “软蛋白冠 ”。 研究发现， 不同的蛋白成 分形成的硬蛋白冠在细胞摄取纳米颗粒和纳米颗粒引起的炎症反应中发挥了不同的作用 (D.Baimanov,J.G.Wu,R.X.Chu,R.Cai,B.Wang,M.J.Cao,Y.Tao,J.M.Liu,M.Y.Guo,J.Wang, X.Yuan,C.D.Ji,Y.L.Zhao,W.Y.Feng*,L.M.Wang*,C.Y.Chen*.Immunological  responses  induced by blood protein coronas on two‑dimension al MoS2nanosheets.ACS  Nano, 2020,14(5),5529 ‑5542.； R.Cai,J.R.Ren,Y.L.Ji,Y.L.Wang,Y.Liu,Z.Q.Chen,Z.F.Sabet, X.C.Wu,I.Lynch,C.Y.Chen*.Corona  of thorns:the  surface chemistry ‑mediated   protein  corona perturbs  the recognition  and immune response  of  macrophages.ACS  Appl.Mater.Interfaces,2020,12(2),1997 ‑2008.)。 研究发现， 体内应 用的多种靶向纳米药物丧失靶向性也是由于表面多层蛋白冠的形成和干扰导致的 (R.Gaspar*.Nanoparticles  pushed off target with proteins.Nat.Nanotechnol., 2013,8(2),79 ‑80.； A.Salvati,A.S.Pitek,M.P.Monopoli,K.Prapainop,F.B.Bomb elli, D.R.Hristov,P.M.Kell y,C.Aberg,E.Mahon*,K.A.Dawson*.Transferrin ‑functionalized   nanoparticles  lose their targeting  capabilities  when a biomolecule  corona  adsorbs on the surface.Nat.Nan otechnol.,2013,8(2),137 ‑143.)。 [0004]目前研究纳 米颗粒表面蛋白冠成分的方法主要依赖于离心分离。 具体来说是将纳 米颗粒与生物液体进行孵育， 使其表面形成稳定的蛋白冠； 然后， 通过离心将纳米颗粒 ‑蛋 白复合物从生物液体中分离， 得到纳米颗粒 ‑蛋白复合物的沉淀物， 洗涤纳米颗粒2次； 加入 5％十二烷基硫酸钠水溶液， 在95℃下加热15分钟， 使纳米颗粒表面的蛋白质变性和剥离， 再通过离心分离纳米颗粒， 收集蛋白冠组分； 最后用质谱进 行检测。 这种离心分离的方法由 于需要经过反复高速离心和连续洗脱， 因此通常保留纳米颗粒表面的硬蛋白冠， 不能获得 纳米颗粒表面松散附着的软蛋白冠。 此外， 对于尺寸非常小、 密度低的纳米颗粒， 很难通过 离心的方法进行分离洗脱。 此外， 离心分离的方法花费的时间较长(通常几分钟到几个小说　明　书 1/11 页 3