(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210911339.1 (22)申请日 2022.07.30 (71)申请人 瑞普高科 （天津） 生物技 术有限公司 地址 300380 天津市西青区辛口镇泰兴 路6 号办公楼三层 (72)发明人 付春香　李守军　刘拓　张晓鹏　 刘爱玲　高明涛　 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种烟酰胺含量的检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种烟酰胺含量的检测方法 及其应用， 所述检测方法为采用高效液相HPLC进 行检测， 将流动相A、 流动相B、 流动相C按比例混 合， 进行等度洗脱； 其中， 流动相A为0.1 ‑0.2％庚 烷磺酸钠水溶液(pH为1.9 ‑2.5)， 流动相B为甲 醇， 流动相C为异丙醇。 本发明方法以达到将供试 品中的主要成分即烟酰胺分离并进行含量测定。 该方法能有效检测1μg/mL到2 0μg/mL浓度范围 内的烟酰胺， 结果准确、 可靠， 能大幅度提高烟酰 胺的监测效率， 具有很强的实用性与推广价 值。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 115112805 A 2022.09.27 CN 115112805 A 1.一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， 采用HPLC法进行检测， 色谱条件如下： 流 动相A、 流动相B和流动相C按比例混合， 进 行等度洗脱； 其中， 流动相A、 流动相B和流动相C 混 合比例为(91 ‑93):(7‑4):(2‑3)； 所述流动相A为0.1 ‑0.2％庚烷磺酸钠水溶液， pH为1.9 ‑ 2.5； 所述 流动相B为甲醇； 所述 流动相C为异丙醇。 2.根据权利要求1所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， 流动相A、 流动相B 和流动相C混合比例为91:7:2。 3.根据权利要求1所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， 所述流动相A为 0.1％庚烷磺酸钠水 溶液， pH为2.1。 4.根据权利要求1所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， 所述流动相A 的制 备方法为： 将 庚烷磺酸钠与水按(10 ‑20):1000的质量体积比混合、 摇匀 后， 用高氯酸调节上 述水溶液的pH值至1.9 ‑2.5。 5.根据权利要求4所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， 所述流动相A 的制 备方法为： 将 庚烷磺酸钠与水按质量体积比为10:1000， 混合、 摇匀 后， 用高氯酸调节上述水 溶液的pH值至2.1。 6.根据权利要求1所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， HPLC的色谱条件 为： 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂， 规格为4.6mm ×150mm； 流速为0.8 ‑1.2mL/ min； 检测波长为25 0‑280nm； 柱温25 ‑35℃； 进样量 为20 μL。 7.根据权利要求6所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特征在于， 流速为1.0mL/min， 柱温为30℃， 检测波长为267nm。 8.根据权利要求6所述的一种烟酰胺含量的检测方法， 其特 征在于， 其检测步骤如下： 步骤一， 提取液的制备为800mL水中加入50mL乙腈， 10mL冰乙酸混合， 用水定容至 1000mL， 混匀即得； 步骤二， 准确称取供试品0.1g至100ml容量瓶 中， 用提取液溶解并定容， 再精密量取5ml 至100ml容量瓶中， 用提取 液稀释并定容， 制成最终浓度为5 μg/mL溶 液； 步骤三， 配制烟酰胺对照品溶液， 使用提取液溶解并稀释制成每1ml中含5.0μg烟酰胺 的烟酰胺对照品溶 液； 步骤四， 设置 HPLC色谱条件； 步骤五， 精密量取供试样品溶液， 注入液相色谱仪， 记录色谱图1； 另取烟酰胺对照品溶 液， 注入液相色谱仪， 记录色图谱2， 按外标法以峰面积计算供 试品中烟酰胺含量。 9.如权利要求1 ‑8中任一所述的一种烟酰胺含量的检测方法在检测1 ‑20μg/mL浓度范 围烟酰胺上的应用。 10.如权利要求1 ‑8中任一所述的一种烟酰胺含量的检测方法在检测饲料添加剂中烟 酰胺含量的检测方法中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115112805 A 2一种烟酰胺含量的检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于制剂分析技 术领域， 具体涉及一种烟酰胺含量的检测方法及其应用。 背景技术 [0002]目前， 对于烟酰胺含量的测定方法有如下几种： [0003]方法一： 《GB  7301‑2017》 饲料添加剂烟酰胺的检测， 以冰乙酸为溶剂， 采用电位滴 定法， 以高 氯酸标准 滴定液滴定供 试品中的氨基为原理进行检测。 [0004]方法二： 《中国兽药典》 烟酰胺的测定， 同样采用高氯酸滴定反应的方法， 与方法一 中的方法大致相同。 [0005]方法三： 采用HP LC法对烟酰胺进行测定： HP LC色谱条件： 流动相为磷酸二氢钾溶液 (0.01moL/L) ‑水‑甲醇‑乙腈(1： 79： 15： 5)， 用氨水调pH  8.0±0.2， 流速为每分钟0.8mL， 柱 温35℃， 检测波长为262nm， 进样量10uL。 [0006]样品检测： 精密称取供试品约10mg， 置100mL量瓶中， 加水适量， 振摇使溶解， 用水 稀释至刻度， 摇匀， 做为供试品溶液(10 μg/mL)， 精密量取10 μL。 注入液相色谱仪， 记录色谱 图； 另取烟酰胺对照品适量。 加水溶解并稀释制成含烟酰胺100 μg/ mL的对照品溶液， 同法测 定。 按外标法以峰面积计算烟酰胺含量。 (海峡药学2009年第21卷第10期， 高效液相色谱法 测定烟酰胺的含量林生 泽(福建省宁德市药品检验所宁德3 52100)) [0007]方法一和方法二的不足之处在于： 高氯酸滴定要求严格， 重现性差， 对人员能力要 求高。 [0008]方法三的不足之处在于： 首先， 色谱柱使用范围应选择pH大于8.0的宽泛色谱柱， 成本偏高， 其次， 选择波长为262nm处的吸收峰， 与通用254nm波长较为接近， 导致其干扰高， 数据准确度底， 最后， 流动相的成分过多， 成本会有所偏高并且准备比较耗时。 [0009]故本领域需要研发一种烟酰胺含量的检测方法， 以克服上述 三种方法的不足。 发明内容 [0010]本发明旨在 解决现有技术中存在的问题， 提供一种烟酰胺含量的检测方法及 其应 用。 [0011]本发明技 术方案如下： [0012]本发明提供了一种烟酰胺含量的检测 方法， 所述测定方法为： 采用HPLC法进行检 测， 色谱条件为流动相A、 流动相B和流动相C按比例混合， 进行等度洗脱； 其中， 流动相A、 流 动相B和流动相C混合比例为(91 ‑93):(7‑4):(2‑3)， 所述流动相A为0.1 ‑0.2％庚烷磺酸钠 水溶液， pH为1.9 ‑2.5； 所述 流动相B为甲醇； 所述 流动相C为异丙醇。 [0013]优选地， 所述 流动相A、 流动相B和流动相C的混合比例为91:7:2。 [0014]优选地， 所述 流动相A为0.1％庚烷磺酸钠水 溶液， pH为2.1。 [0015]所述流动相A为庚烷磺酸钠水溶液， 其制备方法为将庚烷磺酸钠与水按(10 ‑20): 1000的质量体积比混合、 摇匀后， 用高 氯酸调节上述水 溶液的pH值至1.9 ‑2.5。说　明　书 1/7 页 3 CN 115112805 A 3