(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210948819.5 (22)申请日 2022.08.09 (71)申请人 上海海洋大学 地址 201306 上海市浦东 新区沪城环路9 99 号 (72)发明人 林东明　刘必林　李纲　 (74)专利代理 机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 312 27 专利代理师 周一新 (51)Int.Cl. G01N 5/04(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 1/40(2006.01) G01N 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种柔鱼类不同组织脂肪酸质 量分数的测 定方法 (57)摘要 本发明公开了一种柔鱼类不同组织脂肪酸 质量分数的测定方法， 属于生物化学检测领域。 该测定方法包括采集柔鱼类胴体肌肉、 消化腺和 性腺组织鲜样冷冻保存， 分别冷冻干燥至恒重， 研磨粉碎， 用组织脂肪索氏萃取法对上述肌肉、 消化腺和性腺组织样品中脂肪分两个阶段萃取， 得出不同组织的脂肪酸质量分数， 根据脂肪萃取 用的样品干燥重量以及脂肪酸脂肪占比， 得出每 个组织脂肪酸脂肪所对应的样品干燥重量， 根据 测定的脂肪酸浓度得到每个组织的脂肪酸质量 分数， 解决柔鱼类不同组织脂肪萃取时间差异而 导致的组织脂肪萃取不完全以及组织脂肪萃取 过程中被氧化等问题， 可应用于海洋生态学和繁 殖生物生态学等领域开展脂肪酸生物标志物的 测定与分析。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115308078 A 2022.11.08 CN 115308078 A 1.一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法， 其特征在于， 该测定方法包括以 下步骤： 步骤1、 采集 柔鱼类胴体肌肉组织、 消化腺组织和性腺组织的鲜样各5.0 0g； 步骤2、 肌肉组织、 消化腺组织和性腺组织的鲜样零下80℃冷冻保存24 –36小时， 分别置 入冷冻干燥机冷冻干燥至恒重； 步骤3、 称量肌肉组织、 消化腺组织和性腺组织的干燥样品重量， 研磨粉碎， 每个组织称 取0.3–0.5g干燥的粉碎样品， 精确到 ±0.1mg； 步骤4、 使用组织脂肪索氏萃取法对上述肌肉组织、 消化腺组织和性腺组织样品中脂肪 进行两个阶段萃取： 第一个阶段： 分别萃取肌肉、 消化腺和性腺样品组织的部分脂肪含量， 萃取时间均为30 分钟， 萃取得到的部分脂肪物质经旋转蒸发、 氮吹至恒重， 记录脂肪含量， 精确 到±0.1mg； 随后组织脂肪直接用于脂肪酸甲酯化， 置入气相色谱 ‑质谱联用仪的脂肪酸测样瓶， GC ‑MS 测定每个组织的脂肪酸浓度， 单位 为mg/mL； 第二个阶段： 对已经萃取部分脂肪含量后的组织样品继续使用组织脂肪索氏萃取法进 行组织脂肪完全脱脂， 完全脱脂后的组织样品置入干燥烘箱干燥至恒重， 称量此时的组织 样品干重， 根据肌肉、 消化腺和性腺样品组织脱脂前和脱脂后的干重， 得出每个组织的脂肪 含量， 精确到 ±0.1mg； 步骤5、 根据 上述步骤中肌肉、 消化腺、 性腺组织的脂肪含量， 以及用于脂肪酸测定的脂 肪酸脂肪含量， 得 出脂肪酸脂肪含量占脂肪含量的百分比， 单位％； 步骤6、 根据脂肪萃取用的肌肉、 消化腺、 性腺组织样品干燥重量以及上述脂肪酸脂肪 含量占比， 得 出每个组织脂肪酸脂肪含量所对应的样品干燥重量， 单位mg； 步骤7、 根据测定的肌肉、 消化腺、 性腺组织的脂肪酸浓度， 得到每个组织的脂肪酸质量 分数， 公式为： 式中， Fa为组织的脂肪酸质量分数， 单位为mg/mg； c为GC ‑MS测定的脂肪酸浓度， 单位为 mg/mL； hv为组织脂肪酸甲酯化时加入的正己烷体积， 单位为mL； sw为脂肪酸脂肪含量所对应 的样品干燥重量， 单位为mg； k为肌肉、 消化腺、 或性腺组织； i为GC ‑MS测定的每个单体脂肪 酸。 2.根据权利要求1所述柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法， 其特征在于， 所述 柔鱼类为阿根廷滑柔鱼。 3.权利要求1或2所述柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法在海洋生态学和繁 殖生物生态学 领域脂肪酸 生物标志 物测定与分析中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308078 A 2一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物化学检测领域， 具体涉及 一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的 测定方法。 背景技术 [0002]头足类是重要的海洋经济动 物， 被联合国粮农组织认为未来最有开发潜力的渔业 资源种类之一， 其中柔鱼类是世界头足类渔业和我国远洋鱿钓渔业的重要捕捞对 象， 根据 联合国粮农组织的最新数据显示， 近十年来世界商业捕捞的柔鱼类总渔获量约为300万吨/ 年， 同时这些种类在海洋生态系统中占有重要的生态学地位， 在海洋生态食物链中处于中 间位置， 有些种类甚至是其 栖息海域的顶级捕食者。 [0003]脂肪酸在食物链传递过程中相对保守， 可以作为标志物示踪研究对象的营养关 系。 同时， 脂肪酸是动物个体的重要营养物质和能量物质， 影响胚胎发育及正常的生长。 目 前， 脂肪酸作为生物标志物已经成为生态学领域的重要内容， 已经被证实为探究生物生态 学、 摄食生态学等方面的重要技术手段。 最近， 脂肪作为生物标志物也被应用于大洋性柔鱼 类生殖能量积累及其生殖投入策略的研究中， 示踪生殖能量的来源方式及其与栖息海域环 境的选择适应性。 然而， 有别于在摄食生态学上的应用研究， 生殖投入策略研究不仅仅需要 比较分析组织之间、 消费者与被捕食者之间的脂肪酸组成相似性及其变化模式， 还需要进 行脂肪酸质量含量的变化趋势比较。 因此， 在利用气相色谱 ‑质谱联用仪(GC ‑MS)测定研究 对象的脂肪酸浓度后， 需要 进行脂肪酸质量分数的转 化。 [0004]值得注意的是， 脂肪酸测定之前需要萃取测试组织的脂肪。 为了获得准确的脂肪 酸数据， 组织脂肪需要尽可能地萃取完全， 并且过程中要最大可能地降低萃取过程中脂肪 氧化现象的发生。 然而， 柔鱼类不同组织的脂肪含量存在较大的差异， 比如肌肉组织的脂肪 偏低， 平均为湿重的1％ –2％； 而消化腺组织的脂肪含量很高， 平均为湿重的30％ –50％。 因 此， 在萃取这些种类的组织脂肪时， 需要针对不同组织设定不同的萃 取方案， 将给实验带来 较多的时间成本和系统误差。 特别地， 在进 行消化腺组织脂肪萃 取时， 时间会相对很长而导 致脂肪被氧化严重。 为此， 在进 行柔鱼类组织脂肪酸测定时， 需要同时考虑组织脂肪的萃 取 完整和被氧化， 以测定获得准确的脂肪酸质量分数 数据。 发明内容 [0005]本发明的主要目的是提供一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法， 解决 柔鱼类不同组织脂肪萃取时间差异而导致的组织脂肪萃取不完全以及组织脂肪萃取过程 中被氧化 等问题， 准确 测定并得 出柔鱼类肌肉、 消化腺、 性腺不同组织的脂肪酸质量分数。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]本发明提供一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法， 基于组织脂肪索氏 萃取法进行柔鱼类肌肉、 消化腺、 性腺组织的粗脂肪萃 取和脂肪酸测定， 得到不同组织脂肪 酸质量分数， 包括以下步骤：说　明　书 1/4 页 3 CN 115308078 A 3