(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210934940.2 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 中国中医科学院医学实验中心 地址 100700 北京市东城区东 直门内南小 街16号 (72)发明人 张美玉　杜丹丹　陈之　王新原　 孙健　 (74)专利代理 机构 北京精翰专利代理有限公司 11921 专利代理师 杨晓丽 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/53(2006.01) C12Q 1/6883(2018.01) A01K 67/02(2006.01)G01N 30/02(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (54)发明名称 一种小鼠神经病理性疼痛模型验证方法 (57)摘要 本发明提供一种小鼠神经病理性疼痛模型 验证方法， 本发明首次采用Grin2btm1.1(Grin2a)小 鼠在神经病理性疼痛中应用。 本发 明公开了应用 Grin2btm1.1(Grin2a)小鼠， 采用机械纤维丝法检测 机械痛阈， 微透析结合高效液相荧光法检测Glu、 D‑ser、 Gly三种氨基酸含量变化， WesternBlot以 及RT‑PCR检测Panx1、 Src、 NMDAR ‑2B三种蛋白与 基因变化含量情况。 本发明为神经病理性发明提 供了一种新的动物模型， 验证野生型与杂合型 Grin2btm1 .1(Grin2a)小鼠及其CRE对杂合型 Grin2btm1.1(Gri n2a)小鼠的影响。 权利要求书1页 说明书11页 附图8页 CN 115236343 A 2022.10.25 CN 115236343 A 1.一种小鼠神经病理性疼痛模型验证方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 野生型与杂合型Gri n2btm1.1(Gri n2a)小鼠进行比较： S1‑1、 行为学测试： 首先根据小鼠的基因分型对小鼠进行分组， 采用纤维丝机械刺激法 对分组后的小鼠进行机 械痛敏检测； 采用冷喷法对分组后的小鼠进行冷痛敏测试； S1‑2、 采用体外探针采集小鼠脑内Glu、 D ‑Ser和Gly脑微透析液， 测定脑微透析液中的 浓度， 随后对小鼠进行微透析实验； S1‑3、 采用HPLC ‑FLD方法检测小鼠脑 氨基酸类神经递质； S1‑4、 采用WesternBlot方法检测小鼠脑ACC和脊髓SDH区Panx1、 Src、 NMDAR ‑2B的蛋白 水平； S1‑5、 采用RT ‑RCR技术检测小鼠脑 ACC和脊髓S DH区Panx1、 Src、 NMDAR ‑2B的基因水平； S2、 探究CRE对杂合型Gri n2btm1.1(Gri n2a)小鼠的影响： S2‑1、 通过行为学测试纤毛测试丝考 察CRE对杂合型小鼠镇痛活性的影响； S2‑2、 采用微透析结合HPLC ‑FLD方法检测CRE对杂合型小鼠脑ACC区细胞外液中Glu、 D ‑ Ser和Gly的动态变化影响； S2‑3、 通过WesternBlot方法考察CRE对杂合型小鼠脑和脊髓两个维度上Panx1 ‑Src‑ NMDAR相关蛋白分子的变化情况； S2‑4、 通过RT ‑PCR技术探索CRE对杂合型小鼠脑和脊髓两个维度上Panx1 ‑Src‑NMDAR相 关基因分子的变化影响。 2.根据权利要求1所述的一种小 鼠神经病理性疼痛模型验证方法， 其特征在于： 步骤 S1‑2中， 测定脑 微透析液中的浓度以小鼠脑内Glu、 D ‑Ser和Gly脑 微透析液中不同氨基酸类 神经递质的探针体外回收率来折算， 其中， 其中， 探针体外回收率＝(透析液中某递质浓度 均值/混合标准液中该递质浓度均值) ×100％。 3.根据权利要求2所述的一种小 鼠神经病理性疼痛模型验证方法， 其特征在于： 步骤 S1‑2中， 微透析实验包括微透析取样， 微透析取样中， 取小鼠进行麻醉， 麻醉后给小鼠穿上 马甲， 取体外探针采集小鼠脑内Glu、 D ‑Ser和Gly脑微透析液， 而后分别采用腹腔注射艾芬 地尔和灌胃给予不同浓度川芎醇提液， 以观察药物对透析 液中神经递质的影响。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115236343 A 2一种小鼠神经病理性疼痛模型验证方 法 技术领域 [0001]本发明涉及小鼠神经病理性疼痛模型构建方法， 具体为一种小鼠神经病理性疼痛 模型验证方法。 背景技术 [0002]神经病理性疼痛由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的一种常见的慢性疼痛， 对 人们的生产生活质量具有重大影响。 神经病理性疼痛的主要 特征是对刺激的异常敏感和对 非伤害性刺激的伤害性反应， 此类疼痛属于自发发生， 疼痛的特点是自发持续或放射痛， 使 刺激或伤害性反应被无限放大。 Glu、 D ‑ser和Gly等氨基酸类神经递质在中枢神经系统中与 疼痛密切相 关。 中枢敏化在NPP的产生和 发展中发挥着重要作用。 Panx1 ‑Src‑NMDAR(N‑甲 基‑D‑天冬氨酸受体)关联是中枢敏化的一条重要通路。 脊髓背角神经元兴奋性增强是导致 中枢敏化的显著诱因之一， 前扣带回区是慢性疼痛处理的重要脑中枢。 NMDA受体是脑内兴 奋性神经递质 ‑谷氨酸的主要受体， Gly和D ‑ser作为兴奋性神经递质部 分决定NMDAR的活性 程度。 NMDAR与许多蛋白质和分子相互作用， 包括Src和Panx1。 Src是一种非受体型蛋白酪氨 酸激酶， 在调节细胞内信号转导中起着至关重要的作用， 在慢性疼痛条件下可以调节 NMDARs的激活。 Src与NMDARs的GluN2A和GluN2B亚单位物理连接， 外源NMDA/甘氨酸激活Src 家族激酶， 外源性Src家族激酶也足以增强NMDAR通道门控， Src负责打开Panx1， 可能是通过 Panx1C端Y308的磷酸化。 Pannexin1是一种质膜通道， 在神经病理性疼痛中起重要作用， Panx1在癫痫的病理状态下也与NMDARs发生功能性相互作用。 [0003]NMDAR是影响神经元网络兴奋/抑制平衡的关键因素。 NMDAR功能增强型基因突变 和功能丧失型基因突变均可导致癫痫。 发明发现作为NMDAR的亚基之一， GluN2A/GRIN2A突 变的患者中78％表现为癫痫， 是目前NMDAR基因变异相关癫痫发明的重点。 NMDA受体的不同 亚基可以与谷氨酸及甘氨酸这两个配体同时结合， 进而参与调节兴奋性突触传递。 在外周 神经中的肿瘤如畸胎瘤等或外周病毒感染可以导致NMDAR在中枢神经系统外的异 位表达及 NMDAR分子模拟存在， 降低NMDA受体的免疫耐受， 进而使血及脑细胞外液中出现NMDAR抗体， 抗体的存在就会因发生抗原抗体反应而导致突触部位NMDA受体经过蛋白酶体依赖性途径 或者内化作用而 使数量减少， 影响Ca2+内流， 使兴奋性 突触后电位改变， 导 致癫痫发作。 [0004]Grin2btm1.1(Grin2a)小鼠主要用于神 经发育障碍和癫痫等疾病发明， 目前国内外还 未采用该类基因敲除小鼠用于神经痛病理性痛 模型的制备。 因此， 本发明拟采用Grin2btm1.1 (Grin2a)模型小鼠为发明对象， 验证野生型与杂合型Grin2btm1.1(Grin2a)小鼠及其CRE对杂合型 Grin2btm1.1(Gri n2a)小鼠的影响。 发明内容 [0005]针对现有技术存在的不足， 本发明目的是提供一种小鼠神经病理性疼痛模型验证 方法， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0006]为了实现上述目的， 本发明是通过如下的技术方案来实现： 一种小鼠神经病理性说　明　书 1/11 页 3 CN 115236343 A 3