(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211079289.1 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 集美大学 地址 361021 福建省厦门市集美区银 江路 185号 (72)发明人 曾珺　郝静文　黄宝婷　杨志强　 张玥　陈林婕　 (74)专利代理 机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 专利代理师 沈渊琪 (51)Int.Cl. G01N 30/06(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种基于斑马鱼模型判断溴氰菊酯暴露神 经毒性作用的联合型代谢标志 物及检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及斑马鱼样本中脂类代谢物神经 酰胺Cer40:2;2 （d18:1/22:1） 和磷脂酰甘油 PG44:12 （22:6/22:6） 联合使用作为标志物， 用于 判别溴氰菊酯暴露于斑马鱼模型引起神经毒性 作用的新应用以及基于斑马鱼模型开展溴氰菊 酯暴露作用判别的试剂盒。 本发 明通过检测斑马 鱼样品中上述两种脂类代谢物的相对浓度， 基于 二元逻辑回归 方程计算联合标志物变量P以及确 定的截点值， 判别溴氰菊酯的暴露作用。 所述试 剂盒可实现高灵敏、 高效检测本发 明涉及的两种 小分子代谢物， 且具有检测成本低， 重复性好的 特点。 上述两种代谢物联合使用具有较好的应用 前景。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115436537 A 2022.12.06 CN 115436537 A 1.联合型标志物在用于斑马鱼模型中判断溴氰菊酯神经毒性作用中的应用， 所述联合 型标志物包括： 神经酰胺Cer  40:2;2 （d18:1/22:1） 和磷脂酰甘油PG  44:12 （22:6/22:6） 。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于联合型标志物在判断溴氰菊酯暴露后的神经 毒性作用中的应用。 3.联合型标志物在判断溴氰菊酯暴露后的神经毒性作用的方法， 其特征在于， 该方法 采用联合型 标志物变量P进行判断： 其中， a为神经酰胺Cer  40:2;2 （d18:1/22:1） 的相对含量， b为磷脂酰甘油PG  44:12 （22:6/22:6） 的相对 含量， 若P＞0.5则判断为溴 氰菊酯暴露。 4.一种判断溴氰菊酯暴露后的神经毒性作用的试剂盒， 其特 征在于所述试剂盒包括： 标准品： 神经酰胺Cer  35:1;2 （d18:1/17:0） 、 磷脂酰胆碱PC  38:0 （19:0/19:0） 和磷脂 酰甘油PG 32:0 （16:0 /16:0） ； 预处理提取液： 包含内标1.2 μg/mL神经酰胺Cer  35:1;2 （d18:1/17:0） 和1.5 μg/mL磷脂 酰胆碱PC  38:0 （19:0/19:0） 的甲醇溶液； 正离子检测模式下神经酰胺Cer  35:1;2 （d18:1/ 17:0） 用于校正神经酰胺， 负离子检测模 式下磷脂酰胆碱PC  38:0 （19:0/19:0） 用于校正磷 脂酰甘油； 洗脱液： 流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈/水溶液 （v/v=6:4） ， 流动相B为含10mM乙酸铵 的异丙醇/乙腈溶 液 （v/v=9:1） 。 5.利用权利要求4所述的试剂盒计算联合型标志物变量的方法， 其特征在于包括以下 步骤： 1） 以含有内标物的提取液处理来自斑马鱼的样本， 沉淀蛋白后， 进行脂类代谢物的提 取； 2） 将步骤1） 处理后提取的受试样本脂类代谢物进行基于超高效液相色谱 ‑质谱联用的 分离与鉴定； 3） 以试剂盒中神经酰胺Cer  35:1;2 （d18:1/17:0） 和磷脂酰甘油 PG 32:0 （16:0/16:0） 标准品对检测到的离 子进行辅助定性确认； 4） 对每一受试样本中经定性后的两种物质的色谱峰强度分别与样本质量以及提取液 中的内标物比较， 获得两种物质的相对 浓度； 5） 以上述两种代谢物的相对 浓度值， 基于二元逻辑回归方程计算联合型 标志物变量P。 6.如权利要求5所述的利用试剂盒计算联合型标志物变量的方法， 其特征在于该方法 以神经酰胺Cer  35:1;2 （d18:1/17:0） 和磷脂酰甘油PG  32:0 （16:0/16:0） 的标准品对检测 到的离子进行辅助定性确认， 具体包括以下步骤： 1） 将试剂盒中神经酰胺Cer  35:1;2 （d18:1/17:0） 和磷脂酰甘油 PG 32:0 （16:0/16:0） 标准品进行超高效液相色谱 ‑质谱分析， 确定标准品的色谱保留时间、 实测质荷比、 以及二 级质谱特征离子， 结合Lipid  Maps数据库及试剂盒中的神经酰胺C er 35:1;2 （d18:1/17:0） 和磷脂酰甘油PG  32:0 （16:0/16:0） 标准品， 确定神经酰胺和磷脂酰甘油的二级质谱断键规 律： 正离子模式下， 神经酰胺的特征二级为LCB链， 根据其脱 水个数和链结构确定； 负离子模 式下， 磷脂酰甘油的脂肪酸从甘油中协同发生丢失， 可获取m/z为153的特征离子及对应脂权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115436537 A 2肪酸根离子； 2） 受试斑马鱼样品中， 神经酰胺Cer  40:2;2 （d18:1/22:1） 的提取参数为： 正离子模式， 质荷比为620.59760 ±5ppm的色谱峰； 磷脂酰甘油PG  44:12 （22:6/22:6） 的提取参数为:负 离子模式， 质荷比为86 5.50250±5ppm的色谱峰； 3） 分别核对上述色谱峰的二级质谱离子是否符合特征二级质谱断键规律， 同时结合色 谱保留行为， 确认目标脂质。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115436537 A 3