(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210617835.6 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 华东理工大 学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路13 0号 (72)发明人 王泽建　余君雄　张悦　刘昊　 肖慈英　郭美锦　庄英萍　 (74)专利代理 机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 专利代理师 陈静 (51)Int.Cl. C12P 17/12(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 提高依克多因生产效率的方法及应用 (57)摘要 本发明提供了一种提高依克多因生产效率 的方法及应用， 揭示了依克多因发酵过程中新型 调控策略。 所述调控策略包括在发酵过程中通过 特定节点上的盐冲击来刺激细胞。 本发明的方法 在极为有效地提高了依克多因的生产效率的同 时， 还具有产物生产时间短、 低腐蚀性、 低成本、 易于过程控制等优点， 满足了生物反应过程高效 率低能耗以及环境友好的要求。 权利要求书1页 说明书9页 附图4页 CN 114807263 A 2022.07.29 CN 114807263 A 1.一种提高延长盐单 胞菌生产依克多因的效率的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： (1)在适于生长的环境下培 养延长盐单 胞菌； (2)以氧摄取速率和/或二氧化碳释放率为指导， 当其高于110mmol/L/h时， 在培养基中 添加NaCl至终浓度3～15％(w/v)， 进行盐冲击 。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， (2)中， 所述氧摄取速率和/或二氧化碳释放 率达到130 ±20mmol/L/h， 较佳地130 ±15mmol/L/h， 更佳地130 ±10mmol/L/h时， 在培养基 中添加NaCl进行盐冲击； 较佳地， 所述 NaCl为NaCl颗粒。 3.如权利 要求1所述的方法， 其特征在于， (2)中， 在培养基中添加N aCl至终浓度 4～9％ (w/v)， 更 佳地至终浓度4.5～ 9％(w/v)。 4.如权利 要求1～3任一所述的方法， 其特征在于， (2)中， 盐冲击的次数为1～5次， 较佳 地1～3次。 5.如权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 盐冲击的次数为2次， 为： (a)以氧摄取速率和/或二氧化碳释放率为指导， 当其高于110mmol/L/h， 进行第1次盐 冲击； (b)在(a)处 理后1.5～3.5小时， 较佳地的2 ～3小时时， 进行第2次盐冲击 。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， (a)中， 以氧摄取速率和/或二氧化碳释放率 为指导， 当达到130 ±20mmol/L/h， 较佳地130 ±15mmol/L/h， 更佳地130 ±10mmol/L/h或130 ±5mmol/L/h， 进行第1次盐冲击； 盐冲击时， 在培养基中添加NaCl至终浓度4～9％(w/v)， 更 佳地至终浓度4.5～ 9％(w/v)。 7.如权利 要求6所述的方法， 其特征在于， (b)中， 进行第2次盐冲击时， 在培养基中添加 NaCl至终浓度12 ～15％(w/v)， 更 佳地至终浓度12.5～14％(w/v)。 8.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， (1)中， 培养延长盐单胞菌的培养基包括： 碳 源、 氮源以及NaCl， 其中NaCl的含量低于2％， 较佳地低于1.5％； 较佳地， 所述碳源为葡萄 糖， 所述氮源为蛋白胨和酵母 浸膏。 9.如权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述培养基包括： 蛋白胨20 ±6g/L、 酵母浸膏 10±3g/L、 葡萄糖40 ±10g/L、 氯化钠1 ±0.3％(w/v)； 较佳地， 所述培养基包括： 蛋白胨20 ± 4g/L、 酵母 浸膏10±2g/L、 葡萄糖40 ±5g/L、 氯化钠1 ±0.2％。 10.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 培养过程中， 温度为37 ±2℃， 较佳地37 ±1 ℃， 更佳地37±0.5℃； 和/或 pH为7.0±0.3， 较佳地 为7.0±0.2， 更佳地为7.0±0.15； 和/或 培养过程中， 溶 氧浓度不低于 30％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807263 A 2提高依克多因生产效率的方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物合成和发酵领域， 更具体地， 本发明涉及提高依克多因生产效率 的方法及应用。 背景技术 [0002]依克多因(Ectoine)， CAS:96702 ‑03‑3， 化学式为2 ‑甲基‑1,4,5,6, ‑四氢嘧啶 ‑4‑ 羧酸， 又称四氢嘧啶， 是一种于198 5年发现的水溶两性离子的氨基酸衍生物， 其由Galinski 等首次通过核磁共 振法和质谱法鉴定并分离出依克多因。 [0003]依克多因在护肤领域已被开发应用， 具有镇静和舒缓皮肤的作用， 促进皮肤的再 生过程。 由于其优异的抗炎特性， 依克多因甚至用于治疗特应性皮炎(神经性皮炎)或过敏 性皮肤病。 其 也被报导可用于治疗湿疹， 神经性皮炎 。 [0004]依克多因也被批准用于医疗产品及医疗应用领域， 包括治疗和预防污染引起的肺 部疾病， 如慢性阻塞性肺疾病(COP D)和哮喘。 [0005]有的研究表明， Ectoine能够防止可见光引起的皮肤氧化损伤， 其也在防晒配方中 有所应用。 [0006]目前依克多因已被广泛应用于干眼综合征治疗和保健美容等生物医药领域， 作为 原料开发滴眼液、 皮肤创伤药和新型化妆品等产品， 成为 生物制剂研发的热点。 [0007]依克多因的化学合成所需成本高昂， 商业化生产主要依赖微生物发酵法， 通过延 长盐单胞菌 “细菌挤奶 ”过程生产。 但传统工艺条件下步骤繁琐， 且设备处在高盐环境中的 时间长(至少20小时以上)， 提高了生产成本， 导致市场上销售的嗜盐菌来源的依克多因价 格较高， 限制了依克多因产业 化规模的进一 步扩大。 [0008]因此， 本领域亟 待开发成本可控、 环境友好且促进细胞高效产生依克多因的工艺。 发明内容 [0009]本发明的目的在于提供一种提高依克多因生物合成生产效率的方法， 所述方法包 括： 首先在低 盐条件下培养细胞至适当 的OUR和CER， 通过加入NaCl进行盐冲击刺激细胞快 速产依克多因， 盐冲击浓度在5％～13％。 [0010]在本发明的第一方面， 提供一种提高延长盐单胞菌生产依克多因的效率的方法， 包括： (1)在适于生长的环境下培养延长盐单胞菌； (2)以氧摄取速率(OUR)和/或二氧化碳 释放率(CER)为指导， 当其高于110mmol/L/h(较佳地高于120mmol/L/h； 更佳地高于 125mmol/L/h)mmol/L/h时， 在培 养基中添加NaCl至终浓度3～10％(w/v)， 进行盐冲击 。 [0011]在一种或多种实施方式中， 所述适于生长 的环境为“非高盐环境 ”(为低低盐蚀的 环境)， NaCl含量低于2％， 较佳地低于1.5％， 更 佳地低于1.2％， 如为1％。 [0012]在一种或多种实施方式中， (2)中， 所述氧摄取速率和/ 或二氧化碳释放率达到 130 ±20mmol/L/h， 较佳地130 ±15mmol/L/h， 更佳地130 ±10mmol/L/h(如130 ±5)时， 在培养基 中添加NaCl进行盐冲击； 较佳地， 所述 NaCl为NaCl颗粒。说　明　书 1/9 页 3 CN 114807263 A 3