(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211038776.3 (22)申请日 2022.08.29 (71)申请人 上海交通大 学医学院附属第九人民 医院 地址 200011 上海市黄浦区制造局路6 39号 (72)发明人 黄凯　杨盛兵　袁凯　汤亭亭　 (74)专利代理 机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 312 27 专利代理师 胡永宏 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 抗生素耐受性细菌及其培 养方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种抗生素耐受性细菌及其 培养方法和应用， 培养方法包括： 将野生型细菌 的菌落接种在培养基中培养， 再次接种得到对数 期生长菌液； 加入抗生素溶液， 继续培养， 离心， 洗涤， 细菌冻存备用， 剩余细菌进入下一暴露循 环； 将暴露循环的细菌和未处理的野生型细菌分 别稀释， 并加入抗生素培养； 将暴露循环的细菌 和未处理的野生型细菌使用抗生素纸片放置于 该细菌平板上培养， 结束后去除抗生素纸片， 使 用含葡萄糖溶液的纸片在平板上继续培养； 本发 明培养筛选得到的抗生素耐受性细菌可在没有 抗生素耐药性出现的前提下表现出明显的抗生 素耐受性， 所 获得的耐受性细菌对于耐受性细菌 相关难治性感染、 细菌耐药性解决、 感染药物研 发均有重要的支撑作用。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 115322934 A 2022.11.11 CN 115322934 A 1.一种抗 生素耐受性细菌的培 养方法， 其特 征在于： 其包括如下步骤： (1)、 将野生型细菌的菌落接种在无菌CAMHB培养基中过夜培养， 然后再次接种在无菌 CAMHB培养基中至OD600值为0.02， 得到对数期生长菌液； 在所述对数期生长菌液中加入抗生 素溶液， 继续培 养； 培养结束后， 离心收集细菌， 并洗涤数次， 再加入新鲜的CAMHB培养基过夜培养细菌； 再 次离心收集， 2/ 3细菌冻存备用， 1/ 3细菌进入下一 暴露循环； (2)、 使用无菌CAMHB培养基将暴露循环的细菌和未处理的野生型细菌分别稀释， 并加 入抗生素培养， 观察最小抑菌浓度； 将暴露循环的细菌和未处理的野生型细菌均匀涂布于MH平板上， 使用抗生素纸片放置 于该细菌平板上培养， 结束后去除抗生素纸片， 使用含葡萄糖溶液 的纸片放置在该细菌平 板上继续培 养， 观察细菌存活情况。 2.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 所述 过夜培养的温度为3 5‑37℃。 3.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 所述 抗生素溶液中的抗生素选自β ‑内酰胺类抗生素、 多肽类抗生素和抗结合类抗生素中的一种 以上； 优选地， 所述β ‑内酰胺类抗生素选自青霉素、 头孢菌素、 碳青霉烯类抗生素或β ‑内酰胺 酶抑制剂； 优选地， 所述多肽类抗生素选自多黏菌素B、 多黏菌素E、 万古霉素、 去甲万古霉素或壁 霉素； 优选地， 所述 抗结合类抗 生素选自异烟肼或乙胺丁醇。 4.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 所述 继续培养的温度为37℃， 时间为3 0‑300min。 5.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 所述 离心的转速为80 0‑3000rpm， 时间为1 ‑20min。 6.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 所述 加入抗生素后， 培 养的温度为3 5‑37℃， 时间为16 ‑20h。 7.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 所述 使用抗生素纸片， 培 养的温度为37℃， 时间为2 ‑24h。 8.根据权利要求1所述的抗生素耐受性细菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 所述 继续培养的时间为12 ‑48h。 9.一种抗生素耐受性细菌， 其特征在于： 其由权利要求1 ‑8任一项所述的培养方法得 到。 10.一种如权利要求9所述的抗 生素耐受性细菌在耐受性细菌药效材 料评估中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115322934 A 2抗生素耐受性 细菌及其培养方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种抗生素耐受性细菌及其培养方法和应 用。 背景技术 [0002]以抗生素为中心的抗感染治疗是目前应对细菌感染相关疾病的主要手段。 抗生素 耐药细菌的出现与流行使得这一主要治疗方法与人群健康面临严峻挑战。 因此， 阻断细菌 抗生素耐药性进化是防治抗 生素耐药细菌相关感染疾病的重要方法 之一。 [0003]近年来， 细菌抗生素耐受性的发现为探明细菌耐药进化过程提供新的突破口。 与 抗生素耐药性不同， 抗生素耐受性指细菌在抗生素环境中通过下调代谢活动等方式增加细 菌在抗生素暴露中的存活时间。 研究发现， 细菌抗生素耐受充当细菌抗生素耐药性进化的 过渡阶段， 并促进细菌抗生素耐药性的获得。 针对抗生素耐受性的新型诊疗方法开发是抗 感染类药物的重要发展方向。 因此， 稳定的抗生素耐药细菌培养方法对抗生素耐药性细菌 研究起到 重要基础支撑作用。 [0004]目前， 抗生素耐药细菌 的来源主要有患者来源于体外培养两种方法提供。 患者感 染细菌的异质性与不统一的体外培养方法难以为抗生素耐受性研究的广泛开展提供可靠 的基础研究工具。 因此， 有必要开发一种更 稳定的标准 化抗生素耐受细菌的培 养方法。 发明内容 [0005]针对现有技术中的不足， 本发明提供了一种抗生素耐受性细菌及其培养方法和应 用。 即为细菌抗生素耐受性相关的生物基础实验研究与 临床药物疗效研究， 提供一种简单 可标准化的抗生素耐受性细菌的培 养方法。 [0006]为达到上述目的， 本发明的解决方案是： [0007]第一方面， 本发明提供了一种抗 生素耐受性细菌的培 养方法， 其包括如下步骤： [0008](1)、 将ATCC公司的野生型细菌的菌落接种在无菌CAMHB培养基中过夜培养， 然后 再次接种在无菌CAMHB培养基中至OD600值为0.02， 得到对数期生长菌液； 在对 数期生长菌液 中加入抗 生素溶液， 继续培 养； [0009]培养结束后， 离心收集细菌， 并洗涤数次， 再加入新鲜的CAMHB培养基过夜培养细 菌； 再次离心收集， 2/ 3细菌冻存备用， 1/ 3细菌进入下一 暴露循环； [0010](2)、 使用无菌CAMHB培养基将暴露循环的细菌和未处理的野生型细菌分别稀释， 并加入不同浓度的抗 生素培养， 观察最小抑菌浓度； [0011]将暴露循环的细 菌和未处理的野生型细菌均匀涂布于MH平板上， 使用抗生素纸片 放置于该细菌平板上培养， 结束后去除抗生素纸片， 使用含葡萄糖溶液 的纸片放置在该细 菌平板上继续培 养， 观察细菌存活情况。 [0012]优选地， 步骤(1)中， 过夜培养的温度为35 ‑37℃， 优选为37℃。 针对大多数人体寄 生细菌， 所用培养温度范围为35 ‑37℃。 针对特殊种类细菌， 其培养温度由此菌种 最适培养说　明　书 1/3 页 3 CN 115322934 A 3