(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210882520.4 (22)申请日 2022.07.26 (71)申请人 宜宾五粮液股份有限公司 地址 644007 四川省宜宾市岷江西路15 0号 (72)发明人 雷学俊　郑佳　赵东　杨韵霞　 刘多涛　张霞　刘芳　杨康卓　 陈小文　薛惠　 (74)专利代理 机构 成都虹桥专利事务所(普通 合伙) 51124 专利代理师 许泽伟 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12G 3/02(2019.01) C12R 1/145(2006.01) (54)发明名称 定向富集培养梭菌属微 生物的方法 (57)摘要 本发明属于酿 酒微生物发酵技术领域， 具体 涉及定向富集培养梭菌属微生物的方法。 为解决 现有培养基需加入其他化学成分而影响菌体生 长监测、 菌液生产应用等问题。 本发明提供了定 向富集培养梭菌属微生物的方法， 其包括以下步 骤： a、 取窖泥进行培养， 得到窖泥种子富集液； b、 将五粮混合粉碎后， 加水熬煮、 糖化、 沉淀、 过滤 得到天然培养基； c、 将窖泥种子富集液接种到天 然培养基中发酵， 发酵温度为25 ‑37℃， 培养15 ‑ 30天， 即得富集梭菌属微生物的发酵液。 本发明 的天然培养基定向富集梭菌属的菌液未含有其 他化学成分， 能直接用于浓香型白酒应用生产， 有利于梭菌属的科 学研究和窖泥维护。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 115161242 A 2022.10.11 CN 115161242 A 1.定向富 集培养梭菌属微 生物的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： a、 取窖泥 进行培养， 得到窖泥种子富 集液； b、 将五粮混合粉碎后， 加水熬煮、 糖化、 沉淀、 过 滤得到天然培 养基； c、 将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵， 发酵温度 为25‑37℃， 培养15 ‑30天， 即 得富集梭菌属微 生物的发酵 液。 2.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 步骤a中， 所 述窖泥为上层、 下层或底层窖泥中至少一种。 3.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 窖泥窖龄为 15‑50年； 优选地， 窖龄为3 0年。 4.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 步骤b中， 所 述天然培 养基为五粮粉糖化液， 糖化液终浓度为12 ‑13°BX， pH为6.8。 5.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 步骤b中， 满 足以下至少一项： 五粮质量配比为高粱： 大米： 糯 米： 小麦： 玉米＝18： 1 1： 9： 8： 4； 采用液化酶、 糖化酶分别进行液化和糖化， 温度为60 ‑62℃， 酶活性均大于3700活力单 位/克； 液化酶、 糖化酶的添加量均为1 ‑2g/L。 6.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 步骤c 中， 窖 泥种子富 集液按10％ ‑20％体积比接种发酵。 7.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 步骤c 中， 发 酵方式为密封厌氧发酵。 8.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 步骤c 中， 还 包括加入乙醇和/或黄水补充碳源。 9.根据权利要求1所述的定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其特征在于： 所述黄水按 发酵液体积比的1％ ‑3％补充， 所述乙醇按发酵 液体积比的1％ ‑3％补充。 10.权利要求1 ‑9任一项所述定向富 集培养梭菌属微 生物的方法在白酒酿造中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115161242 A 2定向富集培养梭菌属微生物的方 法 技术领域 [0001]本发明属于酿酒微生物发酵技术领域， 具体涉及定向富集培养梭菌属 (Clostridium)微 生物的方法。 背景技术 [0002]梭菌属(Clostridium)被认为是一类主产己酸的己酸菌， 为厌氧或兼性厌氧菌， 是 优质窖泥中的优势 微生物和浓香型白酒酿造过程中重要的风味贡献者， 能将发酵原辅料中 淀粉、 蛋白质、 纤维素等转化为有机酸(乙酸、 丁酸、 己酸)、 醇类、 CO2等物质， 可作为白酒呈 香呈味的前体物质。 同时， 许多研究表明梭菌属对于提高窖泥质量、 维护窖池等方面具有重 要作用， 且其中某些菌株具有高产丁酸、 己酸的能力。 例如， 博士论文 《浓香型白酒窖泥中梭 菌群落多样性与窖泥质量关联性研究》 (胡晓龙.浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥 质量关联性研究[D].江南大学,2015.)从窖泥中筛选分离Clostridium  kluyver N6， 产己 酸量为3.05g/L。 [0003]己酸菌为厌氧或兼性厌氧菌， 要进行可培养的要求特别高， 例如， 专利 CN109971686A提出的己酸增殖培养基由蛋白胨、 牛肉粉、 酵母粉、 葡萄糖、 氯化钠、 醋酸钠、 半胱氨酸盐酸盐、 抗坏血酸、 氯化红血素组成， 采用油液封， 隔绝空气达到无氧培养。 专利 CN1088659 42A公开了不加CaCO3的NCEAM培养基培养Clostridium.kluyveri  Jzz， 但仍含有 硫酸镁、 磷酸氢二钾等类成分。 专利CN102260640B采用的是乙酸钠、 乙醇、 硫酸铵、 丢糟浸 液、 大曲粉、 底锅水等作为已酸菌培养基但也含有硫酸铵、 乙酸钠等化学成分。 专利 CN112011419A提出的产己酸富集的培养基由乳酸钠、 乙酸钠、 氯化钙、 胰蛋白胨等组成， 以 通入氮气去除氧气维持厌氧环境。 [0004]上述专利及目前的培养基中含有钠、 钾等化学成分， 不利于后续相关研究工作的 开展， 如菌体生长监测、 菌液生产应用。 因此， 针对定向富集培养梭菌属(Clostridium)， 提 供一种不添加任何化学成分的培养基， 有利于白酒酿造窖泥的养护， 在白酒生产和实际科 研中具有重要意 义。 发明内容 [0005]为了解决现有培养基需要加入其他化学成分而影响菌体生长监测、 菌液生产应用 等问题。 本发明采用天然培 养基， 提供定向富 集培养梭菌属微 生物的方法。 [0006]为了实现上述目的， 本发明首先提供了定向富集培养梭菌属微生物的方法， 其包 括以下步骤： [0007]a、 取窖泥 进行培养， 得到窖泥种子富 集液； [0008]b、 将五粮混合粉碎后， 加水熬煮、 糖化、 沉淀、 过 滤得到天然培 养基； [0009]c、 将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵， 发酵温度为25 ‑37℃， 培养15 ‑30 天， 即得富 集梭菌属微 生物的发酵 液。 [0010]其中， 步骤a 中， 所述窖泥为上层、 下层或底层窖泥中至少一种。说　明　书 1/7 页 3 CN 115161242 A 3