(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210996939.2 (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 沈阳药科大学 地址 117004 辽宁省本溪市高新 技术产业 开发区华佗大街26号 (72)发明人 孙孟驰　孙进　李吉威　刘林林　 杨伟光　 (74)专利代理 机构 沈阳东大知识产权代理有限 公司 21109 专利代理师 李珉 (51)Int.Cl. A61K 9/50(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 33/32(2006.01) A61P 1/00(2006.01)A61P 1/04(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) C12N 1/20(2006.01) A61K 31/155(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递 送系统及其制备方法和应用 (57)摘要 基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递 送系统及其制备方法和应用， 属于医药技术领 域， 具体公开了采用了益生菌Escherichia  coli  Nissle 1917来源的细菌外膜囊泡包载二氧化锰 纳米酶， 制备成纳米益生菌体。 细胞实验显示， 该 纳米益生菌体能清除细胞内过量的活性氧， 同时 并未对细胞造成损伤。 进一步动物试验证实， 该 纳米益生菌体可以黏附于炎症的结肠上皮并有 效清除肠 道过量的ROS。 此外， 与抗炎药二甲双胍 联用后还可以重塑促炎微环境， 提高肠道菌群的 丰富性和多样性， 比市售IBD药物具有更好的疗 效。 本发明制备的纳米益生菌体能够显著治疗 IBD， 并具有良好的安全性， 有望开发为治疗IBD 和其他胃肠道疾病的药物。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 115350161 A 2022.11.18 CN 115350161 A 1.一种基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统， 其特征在于， 其为以工程化 益生菌外膜囊泡 为载体， 内部荷载纳米酶的纳米益 生菌体。 2.根据权利要求1所述的基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统， 其特征在 于， 所述工程化益生菌外膜囊泡为工程化益生菌所分泌的细菌外膜囊泡， 所述的工程化益 生菌选自E.coli ‑BL21、 E.coli ‑1917、 E.coli ‑K12、 E.coli ‑MG1655、 E.coli ‑TOP10、 奥奈达 希瓦氏菌MR ‑1、 减毒沙门氏菌VNP20009、 蛭弧菌中的一种或多种； 所述的被荷载于囊泡内部 的纳米酶为可以清除ROS的功能性ROS清除酶， 选自Pt、 Ag、 Cr、 MnO2、 FeCl3、 CuO、 Cr2O3、 MnO2、 Fe2O3、 CoO、 NiO、 Cu2O、 ZnO中的一种或多种。 3.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方 法， 其特征在于， 按以下步骤制备纳米益 生菌体： 益生菌接种培养， 菌体OD值达到1.0后收集菌液； 离心除去菌体后， 超滤浓缩法和超速 离心制备OMVs， ‑20℃分装冻存； 含有油酸的高锰酸钾乳液经过搅拌、 离心、 洗涤和真空冷冻 干燥的步骤得到二氧化锰纳米花； 二氧化锰纳米花固体粉末分散于PBS中， 与OMVs 的PBS溶 液均匀混合， 挤出， 将挤出液在4℃， 6000g条件下离心20min， 弃去上清液， 收集底部沉淀即 得所制备的纳米益 生菌体。 4.根据权利要求3所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方法， 其特征在于， 所述工程 化益生菌为E.co li‑1917。 5.根据权利要求3所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方法， 其特征在于， 所述OMVs与MnO2混悬液来回挤出10次。 6.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统 的应用， 其 特征在于， 所述纳米益 生菌体在药物传递系统中的应用。 7.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统 的应用， 其 特征在于， 所述纳米益 生菌体在治疗肠道性疾病药物中的应用。 8.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统 的应用， 其 特征在于， 所述纳米益 生菌体在制备注射给 药、 口服给 药或局部给 药系统中的应用。 9.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统 的应用， 其 特征在于， 所述纳米益 生菌体在缓解氧化应激微环境中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115350161 A 2基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米 酶递送系统及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于医药技术领域， 涉及载药纳米粒， 具体涉及一种基于工程化益生菌外 膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备， 以及其在抗炎性肠炎方面的应用。 背景技术 [0002]炎症性肠病(IBD)， 包括克罗恩病和溃疡性结肠 炎， 是一种典型的胃肠道慢性炎症 性疾病。 其发病机制与肠道氧化应激、 肠道菌群失调、 促炎微环境失调密切相关。 传统的医 学IBD治疗集中于抑制系统免疫系统， 引起脱靶的副作用， 增加感染的风险。 因此， 临床迫切 需要有效治疗IBD的方式。 [0003]肠道微生物群 的失调是IBD的一个重要标志， 这表明肠道微生物群 的重塑可能会 缓解IBD。 有一些证据表明， 将益生菌移植到患病动物的肠道中可以缓解这种疾病， 而微生 物物种的多样性对健康有直接影响。 这一理论最成功的应用之一是使用粪便微生物群移 植 (FMT)治愈复发性艰难梭菌感染。 这种以细菌为基础的生物疗法在临床已被证明可以减轻 肠道感染。 然而， FMT可能导致侵袭性多药耐药微生物传播的潜在风险， 并可能产生严重的 不良反应。 这 一在FMT中暴露的安全问题揭示了当前细菌介导的生物治疗的困境。 [0004]益生菌衍生的外膜囊泡(OMVs)， 自然来源于革兰氏阴性菌， 具有直径为20 ‑400nm 的双脂层。 OMVs由多个生物分子组成， 如蛋白质、 脂质和细菌特异 性抗原， 在解毒、 基因传递 和细菌‑细菌通信中发挥重要作用。 具有解毒成分和易于大规模生产的OMVs被认为是生物 医学应用的细菌替代品。 一方面， 在澳大利亚， 益生菌EcN作为 的主要成分， 已作 为一种注册的补充 药物， 用于临床缓解和管理慢 性便秘。 另一方面， 据报道由幽门螺杆菌衍 生的OMVs包裹的聚(乳酸共乙醇酸)纳米颗粒继承了天然的细菌粘附素， 以阻断幽门螺杆菌 与胃上皮细胞 的结合。 它们作为致病性幽门螺杆菌的竞争对手， 减少 了幽门螺杆菌对小鼠 胃的粘附。 该安全有效的平台为 IBD和其他胃肠道疾病提供有效的治疗 途径。 [0005]经文献检索等， 迄今为止， 尚未发现有益生菌Escherichia  coli Nissle 1917的 OMVs制备包被二氧化锰的OMVs载 药系统， 并进行IBD及其 他胃肠道疾病研究的相关报道。 [0006]基于现有技术的现状， 本申请的发明人拟提供一种益生菌衍生的外膜囊泡包被纳 米酶的制备及其用途， 尤其是源于益生菌Escherichia  coli Nissle 1917的外膜囊泡包 载 的二氧化锰纳米酶用于制备治疗IBD实例。 发明内容 [0007]本发明的目的是基于现有技术的现状， 提供一种基于工程化益生菌衍生外膜囊泡 包被纳米酶递送及其制备方法， 以及其在抗炎性肠炎方面的应用， 尤其是源于益生菌 Escherichia  coli Nissle 1917的外膜囊泡包载二氧化锰纳米酶在制备治疗IBD的药物中 的用途。 [0008]本发明从益生菌E scherichia  coli Nissle 1917中分离细菌外膜囊泡， 并采用该说　明　书 1/7 页 3 CN 115350161 A 3