(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211003442.2 (22)申请日 2022.08.22 (71)申请人 博奥生物集团有限公司 地址 102206 北京市昌平区生命科 学园路 18号 申请人 清华大学 (72)发明人 魏姝瑾　焦点　邢婉丽　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 利用ε-聚赖氨 酸富集细菌细胞外囊泡的方 法 (57)摘要 本发明涉及生物医药领域， 尤其涉及利用 ε‑聚赖氨酸富集细菌细胞外囊泡的方法。 本发 明首次提出了利用ε ‑聚赖氨酸从生物样品中富 集细菌细胞外囊泡的方法。 与经典的超速离心法 相比， 本发明仅需普通高速离心机， 无需使用大 型昂贵离心设备； 与切向流过滤、 静水过滤等方 法相比， 本发明不需要设计制作特殊过滤装置， 操作简便； 且本方法采取沉淀的方式， 与超滤 以 及亲和分离方法相比， 具有独有的大体积样本处 理能力； 本发明使用的试剂 包括ε‑聚赖氨酸， 与 亲和分离方法使用的抗体和核酸适配体等相比 成本较低， 具有较好的经济实用性和临床应用前 景。 此外， 本方法有潜力从体液等复杂样品中沉 淀细菌来源的囊泡， 能推动细菌囊泡检测和应用 研究的发展。 权利要求书1页 说明书7页 附图13页 CN 115074301 A 2022.09.20 CN 115074301 A 1.分离细菌外囊泡的方法， 其特征在于， 所述方法包括将ε ‑聚赖氨酸与细菌细胞外囊 泡共孵育， 离心收集 沉淀， 经洗涤、 释放、 超滤后置换 溶液， 获得囊泡。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述共孵育前还包括将MES缓冲液与细菌 菌液混合， 调pH值到7； 所述M ES缓冲液与细菌 菌液的体积比为1:9。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述共孵育步骤中ε ‑聚赖氨酸的浓度 为30 μg/mL~100 μg/mL。 4.根据权利要求1~3任一项所述的方法， 其特征在于， 所述共孵育的时间为15min~ 60min， 室温18℃~30℃。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述离心的条件包括4℃转速2,000g~12, 000g， 时间4mi n~16min。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述洗涤包括以PBS溶液洗涤2次； 所述释 放包括使用释放缓冲液重悬沉淀， 所述释放缓冲液为5 0 mM Tris， 0.5 M~1M NaCl， pH为8~9。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述超滤包括超滤后液体体积的浓缩倍数 为5倍； 所述超滤采用的超滤 管规格为10 0kDa。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述置换溶液包括以PBS溶液置换直至滤 出液的pH值 为7。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述细菌包括大肠杆菌和/或金黄色葡萄 球菌。 10.权利要求1~9任一项所述的方法制得的囊泡。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074301 A 2利用ε‑聚赖氨酸富集细菌细胞外囊泡的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药领域， 尤其涉及利用 ε ‑聚赖氨酸富集细菌细胞外囊泡的方 法。 背景技术 [0002]细菌细胞外囊泡 （bacter ial extracellular  vesicle, BEV） 是一类由细菌产生、 分泌到细胞外的膜 性囊泡， 直径 一般在20 ‑200 nm之间。 分泌 胞外囊泡是包括革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌在内的众多细菌存在的保守功能。 BEV由一层脂质双分子层 包裹， 对于革兰 氏阴性菌， 细菌外囊泡膜与细菌细胞外膜同源， 表面带有细胞外膜成分脂多糖 （lipopolysaccharides,  LPS） ， 对于革兰氏阳性菌， 细菌外囊泡膜与细胞膜同源， 表面还含 有一部分细菌细胞壁的成分例如脂磷壁酸 （lipoteichoic  acid, LTA） 。 BEV内含有蛋白质、 核酸、 脂质等多种生物分子， 其内容物可被释放到周围环境中或者其他细胞之中来执行不 同的功能。 BEV在细菌的生长、 增殖及细胞间信息交流中发挥着多种多样的作用。 已有研究 发现， BEV在人体宿主中也广泛存在， 是细菌与宿主沟通交流的重要媒介， 在诊断和治疗都 具有极大的应用潜力。 由于BEV粒径微小， 难以从生物样本中分离， 给领域的发展带来了困 难。 [0003]ε‑聚赖氨酸是一种 天然的广谱阳离子抗菌肽， 由放线菌发酵产生。 细菌细胞外囊 泡表面带有丰富的负电荷， 可以和带正电荷的ε ‑聚赖氨酸发生相互作用。 [0004]目前最常用的BEV提取方法是基于密度的超速离心法 （ultracentrifugation,   UC） ： 首先通过高速离心和0.22 μm或者0.45 μm滤膜除去细菌细胞和大部分的细胞碎片等， 然 后用超过十万g的超速离心对上清液进 行最少2h的离心， 收集沉淀， 随后需要通过一步清洗 重悬再次超速 离心对BEV进行 纯化。 [0005]另外， 还有基于BEV大小的分离方法， 例如 超滤法 （ultrafiltrat ion, UF） 、 剪切流 过滤 （tangential  flow filtration,  TFF） 以及静水过滤 （Hydrostatic  filtration,   HF） 。 对于超滤法， 通过一个100 ‑500kDa的超滤管对去掉细菌细胞的上清液进行超速离心。 剪切流过滤是一个相对较新的方法， 同样使用一个滤膜， 只不过滤膜方向和液体流向是切 向设置， 在一定程度上可以减少BEV对于滤膜的阻塞。 静水过滤通过对一个1000kDa的滤膜 施加静水压力对含有BEV的上清进行过滤， 随后对浓缩的上清进行重悬， 并通过0.45 μm滤膜 过滤， 再次通过第二步超滤步骤， 以及静态透析的方法进行纯化， 最后通过过滤管浓缩收 集。 [0006]基于亲和力的分离方法主要有抗体法和核酸适配体方法。 这两种方法都基于BEV 表面一些特征性蛋白， 设计对应特异性结合的抗体或者核酸适配体， 并将它们 连接上组蛋 白标签或者磁珠等易于富集的载体， 待抗体或者核酸适配体与BEV结合后， 通过对与抗体或 核酸适配体结合的标签或者磁珠等 富集来对BEV进行收集。 [0007]之前的技术并不专注于分离细菌细胞外囊泡， 细菌属于原核生物， 其细胞膜在组 成和与哺乳动物膜系统具有巨大的差异， 导致产生的囊泡在性质上也与哺乳动物细胞外囊说　明　书 1/7 页 3 CN 115074301 A 3