(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210990430.7 (22)申请日 2022.08.18 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.24423 2022.02.23 (71)申请人 北京农学院 地址 102206 北京市昌平区回龙观镇北农 路7号 (72)发明人 崔德凤　张永红　吴琼　张华　 周波　李志敏　卢天航　 (74)专利代理 机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11498 专利代理师 王加岭 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/38(2006.01)A23K 10/12(2016.01) A23K 10/30(2016.01) A23K 10/37(2016.01) A23K 20/28(2016.01) A23K 50/30(2016.01) A23K 50/60(2016.01) A23K 50/75(2016.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 凝结芽孢杆菌BC-HYC株菌剂 的制备方法及 应用 (57)摘要 本发明新分离得到一株凝结芽孢杆菌BC ‑ HYC株， 其具有耐热、 耐人工胃、 肠液、 胆盐等抗逆 性， 且相比发 明人早期分离得到的凝结芽孢杆菌 BC‑CUI株具有更好的抗逆性能。 进一步地， 将所 述凝结芽孢杆菌BC ‑HYC株制备 成菌剂， 其可以用 于发酵饲料的生产， 所制备得到的发酵饲料呈现 酸性， 且小肽含量相对更高， 在基础日粮的基础 上添加所述生物发酵饲料可以提高动物的平均 日增重值和平均采食量， 降低料肉比， 提高养殖 的经济效益； 另外， 所述菌剂还可 以用于预防仔 猪腹泻以及用于饲料的生产， 用于断奶仔猪的饲 喂， 其也能显著提高断奶仔猪的日均增重量和采 食量， 降低料肉比， 提高养殖的经济效益。 权利要求书1页 说明书10页 附图1页 CN 115094012 A 2022.09.23 CN 115094012 A 1.一种凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法， 包括菌种活化、 一级种子液的制备、 二级种子液 的制备、 发酵液的制备和喷雾干燥， 其特征在于， 所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌BC ‑HYC 株， 于2022年02月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心进行保藏， 命分 类名称为： 凝结芽孢杆菌  Bacillus coagulans， 保藏号为： CGMCC No.24423。 2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌 菌剂的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： （1） 菌种活化： 将保存的凝结芽孢杆菌BC ‑HYC株菌种平板划线接种至MRS平板培养基 上， 42℃的保温箱中培 养24h， 使得保存的菌种活化； （2） 一级种子液的制备： 从平板上挑取单菌落， 接种于装有MRS液体培养基的三角瓶中， 42℃下摇床培 养， 120rpm培 养12h， 使得OD600值≥0.8， 获得一级种子液； （3） 二级种子液的制备： 将制备得到的一级种子液按照1%的体积比接种至MRS液体培养 基中， 42℃下摇床培 养， 120rpm培 养8h， 使得OD600值≥0.7， 获得二级种子液； （4） 发酵液的制备： 将二级种子液按照2%的体积比接种至发酵培养基中， 然后置于生产 罐中进行发酵， 发酵12h后过 滤并对滤 液进行梯度稀释， 得到浓度≥108cfu/g的菌种液； （5） 在制备的发酵液中加入25 ％的沸石粉， 混匀， 进行喷雾干燥， 得到水分含量≤5%、 活 菌数≥1×1010CFU/g的菌粉。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 其中步骤 （4） 的发酵培养基组成为花 生饼粉1%、 豆粕2%、 玉米粉2%， 磷酸氢二钾0.1%， 七水合硫酸镁0.02%， 糖蜜2%， 其余为水， 以 上百分含量 为质量体积百分含量， pH为6.5 ‑7.0， 121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 4.利用权利要求1 ‑3中任一项所述方法制备得到的菌剂制备发酵饲料中的方法， 其特 征在于： 所述发酵饲料的制备 方法包括如下步骤： 步骤一. 将玉米粉、 麸皮、 豆粕、 米糠和沸石粉提前粉碎过1.5mm筛子， 而后按照10:35: 20:10:15的重量份 配比称取玉米粉、 麸皮、 豆粕、 米糠、 沸石粉， 混合均匀得到发酵基料； 步骤二. 称取50重量份的水， 将实施例4所述的凝结芽孢杆菌菌剂溶解于水中得到发 酵剂， 其中菌剂按照1g/kg发酵基料进行称取； 步骤三. 将所述发酵剂与发酵基料混合均匀， 在温度40℃、 空气湿度为60 ‑65%的条件 下有氧发酵 72h， 而后干燥至含水量≤8%， 即得到所述发酵饲料。 5.一种发酵饲料， 其特 征在于， 所述发酵饲料采用权利要求 4所述的方法制备 得到。 6.根据权利要求1 ‑3中任一项所述方法制备得到的菌剂在制备饲料中的应用， 其特征 在于， 所述饲料在添加了所述菌剂， 使得饲料中凝结芽孢杆菌BC ‑HYC株菌粉的含量≥ 1011CFU/kg。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094012 A 2凝结芽孢杆菌 BC‑HYC株菌剂的制备方 法及应用 [0001]技术领域： 本发明属于生物技术领域， 具体涉及凝结芽孢杆菌B C‑HYC株菌剂的制备方法及 应 用。 [0002]背景技术： 2020年7月1号起， 饲料生产企业暂停生产含有促生长类药物饲料添加剂 （中药类 除外） 的商品饲料， 俗称禁抗令， 标志着我国全面进入饲料无抗新时代。 禁抗令的颁布和实 施， 在饲料市场引起轩然大波， 在动物疫病错综复杂， 尤其是非洲猪瘟常态化的背景下， 如 何平稳地过渡到 “无抗时代 ”， 已成为畜牧全行业关注的焦点与挑战， 各种替抗产品层出不 穷， 以生物技术为主导的畜牧生物产业正加速形成， 并推动畜牧业高效快速的发展。 微生物 饲料添加剂被认为是抗生素 的潜力替代物之一， 具备改善生长性能、 调节免疫反应和平衡 肠道微生物菌群等作用。 乳酸菌作为益生菌株应用于畜禽养殖历史悠久， 其中应用较多的 为嗜酸乳杆菌、 植物乳杆菌、 粪肠球菌和双岐杆菌等。 酵母菌类因其可以产香的特点进而增 加适口性， 但此类制剂抗逆能力差， 活菌存活率低， 影响其饲喂效果。 芽孢杆菌类益生菌因 芽孢抗逆性强， 可以直接添加至配合饲料中。 [0003]凝结芽孢杆菌是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌， 类属芽孢杆菌属。 菌体表面无鞭毛， 呈头发丝状， 长约2.5 ‑5.0 μｍ， 宽约0.6 ‑1.0 μｍ； 芽孢端生， 如 “榔头”状； 喜中性偏酸pH， 最 适温度为37 ‑45℃。 在其生长过程中可利用多种糖类物质， 经同型乳酸发酵生成L ‑乳酸， 具 有乳酸菌类同样的保健功效， 也具有芽孢杆菌属耐酸 （pH＞2.42） 、 耐热 （80℃） 、 耐盐 （1 ‑8％  NaCl） 、 容易培养和耐储存的特点。 凝结芽孢杆菌 （ Bacillus  coagulans ） 是分泌乳酸的芽孢 杆菌属益生菌， 因其具有 “二重性”， 既具有芽孢杆菌的特点， 还具有乳酸菌的优势， 作为新 型益生菌， 已获得包括美国、 欧盟等国家的认可， 我国于2004年已经批准凝结芽孢杆菌的使 用， 已被广泛应用于食品、 畜牧业、 医药行业、 水产养殖业。 近年来， 凝结芽孢杆菌作为可以 形成芽孢的益生乳酸菌， 因其良好的抗逆性和益生特性成为饲料微生物添加剂的研究热 点， 在2013年被农业农村部正式列入 《饲料添加剂 品种目录》 。 许多研究结果表明凝结芽孢 杆菌具有多种生物特性， 例如抗菌、 调节肠道菌群平衡、 抗炎、 改善机体免疫功能、 促进消化 吸收和改善仔猪腹泻等， 饲粮中添加单一凝结芽孢杆菌能通过抑制大肠杆菌、 沙门氏菌等 肠道主要有害菌， 显著改善畜禽生长性能； 还有研究表明凝结芽孢杆菌可以通过调节肠道 菌群平衡、 促进肠道健康与营养物质吸收等方面提高蛋禽养殖效益。 凝结芽孢杆菌除具备 普通乳酸菌的调节肠道内菌群平衡、 促进营养物质代谢和 提高免疫力的作用外， 还具有耐 胆盐、 耐胃肠消 化液、 热稳定性等生物特性。 在动物饲粮中添加凝结芽孢杆菌， 芽孢化的菌 体形态， 能够顺利通过制粒条件、 动物胃液环境， 进入十二指肠， 然后， 芽孢萌发形成营养 体， 随后进入小肠， 开始 迅速生长繁殖， 并发挥生物学功能。 因此， 开 发抗逆性 强且对动物 健 康有益的菌种以丰富凝结芽孢杆菌的资源库， 开 发有效的益生菌制剂成为全国高度关注的 重大课题。 [0004]发明内容： 为了解决以上技术问题， 本发明旨在提供一种凝结芽孢杆菌菌剂及其制 备方法、说　明　书 1/10 页 3 CN 115094012 A 3