(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210955530.6 (22)申请日 2022.08.10 (71)申请人 合肥中科易康达生物医学有限公司 地址 236000 安徽省合肥市高新区习友路 与石莲南路交口西北角中科院 （合肥） 技术创新工程院研发楼5 07 (72)发明人 朱灿灿　朱灵　李亚楠　杨柯　 洪承刚　胡安中　邓国庆　刘勇　 (74)专利代理 机构 合肥市浩智运专利代理事务 所(普通合伙) 34124 专利代理师 张景云 (51)Int.Cl. C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) B01L 3/00(2006.01)C12Q 1/6848(2018.01) (54)发明名称 集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体 的离心式微 流控芯片及方法 (57)摘要 本发明提供一种集等温扩增和CRISPR/Cas 核酸检测于一体的离心式微流控芯片， 包括一个 或多个反应单元， 按照液体流向， 所述反应单元 依次包括进样腔、 第一连接通道、 反应腔、 第二连 接通道、 检测腔； 所述第二连接通道包括弯曲部， 液体流经所述弯曲部的阻力大于液体流经第一 连接通道的阻力。 本发明通过在反应腔与检测腔 中间加入弯曲部的第二连接通道， 从而使第二连 接通道的阻力大于第一连接通道， 即液体经过第 一连接通道所需的离心力小于第二连接通道， 通 过不同的离心力设定可保证在第一个阶段液体 只进入反应腔， 增大离心力可使反应腔内的液体 进入检测腔， 避免了样品在第一次离心时进入检 测腔， 影响后续检测反应 。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 115305183 A 2022.11.08 CN 115305183 A 1.集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片， 其特征在于， 包括 一个或多个反应单元， 按照液体流向， 所述反应单元依 次包括进样腔、 第一连接通道、 反应 腔、 第二连接通道、 检测腔； 所述第二连接通道包括弯曲部， 液体流经所述弯曲部的阻力大 于液体流经第一连接通道的阻力。 2.根据权利 要求1所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯 片， 其特征在于， 在第一离心力作用下， 液体通过第一连接通道进入反应腔， 并停留在反应 腔， 在第二离心力作用下液体从反应腔穿过第二连接通道进入检测腔， 所述第一离心力小 于第二离心力。 3.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流 控芯片， 其特 征在于， 所述弯曲部自第二连接通道的起始端开始。 4.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流 控芯片， 其特 征在于， 所述第一连接通道为 直管。 5.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流 控芯片， 其特 征在于， 所述弯曲部为 直角转弯的蛇形通道。 6.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流 控芯片， 其特 征在于， 在所述检测腔的上游还设置有缓冲腔。 7.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流 控芯片， 其特征在于， 多个所述反应单元以微流控芯片的转动中心 为圆心放射性均匀布置， 多个所述反应单元的进样腔首尾连通， 其中第一个反应单元的进样腔进口和最后一个反应 单元的进样 腔出口为样品进出口。 8.根据权利要求7所述的等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯 片， 其特征在于， 相邻两个进样 腔之间的连接通道为 窄颈结构。 9.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流 控芯片， 其特 征在于， 所述反应单 元除第二连接通道外为呈轴对称结构。 10.集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片的使用方法， 其特 征在于， 应用于 权利要求1至9任一所述的芯片， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将待测的核酸样本加入所述反应单元的进样腔后， 启动离心机开始第一阶段的离心， 使样品从进样腔进入反应腔， 进行核酸扩增程序； 在核酸扩增结束后， 进行第二阶段离心， 使反应腔 内的液体进入检测腔， 在检测腔 内进行核酸检测 程序， 其中第一阶段的离心转速 小于第二阶段的离心转速 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115305183 A 2集等温扩增和CRI SPR/Cas核酸检测于一体的离心 式微流控芯 片及方法 技术领域 [0001]本发明属于微流控 芯片技术领域， 具体来说是一种集等温扩增和C RISPR/Cas核酸 检测于一体的离心式微 流控芯片及其方法。 背景技术 [0002]现场即时检测(Point  of Care Test,POCT)对于预防和有效应对传染病爆发至关 重要。 而简单易用、 多功能、 高灵敏度且快速的核酸检测方法是POCT的关键。 目前核酸检测 的主要方法是通过聚合酶链式反应(Polymerase  chain reaction,PCR)实现靶基因的扩 增， 后续再通过琼脂糖凝胶电泳实现结果可视化， 或者可以通过荧光 实时定量P CR在仪器上 进行实时检测。 P CR技术因灵敏度高、 特异 性好等优势， 成为核酸检测的经典方法。 但该技术 依赖于精密的温控系统， 设备价格高昂， 反 复升降温导致扩增时间较长， 且需要专 业的操作 人员， 无法很好得满足现场快速检测的需求。 [0003]规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered  regularly  interspaced  short  palindromic  repeats， CRISPR)是细菌中一种适应性免疫系统， CRISPR ‑Cas系统以其特异 性高、 可开发性强、 简单、 高效等特点， 成为基因编辑领域发展最快、 应用最广的技术。 既为 体内基因编辑技术带来革命性突破， 也为体外诊断领域开拓了新的方向。 基于CRISPR ‑Cas 系统的体外诊断技术在病原体核酸检测方面展示出良好性能， 在肿瘤基因诊断、 遗传病筛 查、 移植排斥反应检测等方面也具有很大潜力。 将 CRISPR‑Cas系统应用于核酸检测， 在提高 诊断结果的可靠性方面表现出超高的灵敏度和单碱基分辨率的特异 性， 同时兼具检测时间 短、 成本低、 便携式设计的特点， 开辟了新 一代核酸POCT的应用场景， 具有极大的市场潜力。 [0004]将CRISPR ‑Cas系统与PCR或等温扩增技术相结合， 在CRISPR检测前对目的片段进 行扩增富集， 可以显著 提高检测灵敏度。 但核酸扩增和CRISPR ‑Cas体系是两个独立反应， 即 需先进行核酸扩增， 然后再将扩增产物转移到CRISPR系统中进行靶基因检测 。 在转移过程 中， 由于存在 扩增后开盖、 产 物转移、 闭盖等操作， 极易造成实验室气溶胶污染， 导致检测结 果假阳性， 且在短时间内较难解决。 另外， 由于激活后的Cas酶具有非特异反式切割功能， 可 以无差别切割荧光报告分子， 导致CRISPR ‑Cas体系无法实现多靶标同时检测， 该项不足限 制了CRISPR ‑Cas方法在多种病原体筛查中的应用。 因此， 迫切需要建立一种方法或研制一 种装置， 在 扩增结束后， 完成产 物得自动化、 全封闭转移； 同时， 又能实现多个靶基因的同时 扩增与检测。 [0005]公布号为CN112695073A的发明申请公开了一种RPA ‑CRISPR一步式核酸检测方法。 所述核酸检测方法将待测溶液、 RPA试剂混合放置在管底， 将crRNA与Cas12a蛋白预装到注 射器， 在扩增反应后， 通过推动注射器的活塞使 得crRNA和Cas12a蛋白与反应 混合物混合进 行反应， 再通过蓝光激发， 得到检测结果。 此方法通过注射器和 离心管的结合将RPA反应和 CRISPR反应整合到相对密闭的体系中， 避免了核酸污染， 具有一定的优越性。 但是在操作过 程中需要手动操作注射器， 步骤繁琐且无法实现多个靶基因的同时检测。说　明　书 1/6 页 3 CN 115305183 A 3