(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210724741.9 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 赵清　魏广昊　胡蕊　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 王春霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12M 1/42(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分 子进行减速和/或捕获的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于纳米孔器件利用介 电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法。 如 下步骤： 制作固态纳米孔薄膜； 将固态纳米孔薄 膜作为分 隔电解池的正极和负极的隔膜， 得到纳 米孔测序装置； 采用纳米孔测序装置进行检测； 将待测的单分子加入至电解池的负极接地腔室 中； 测试时， 在隔膜的两端施加直流电压， 通过导 电层引入交流电压， 分别对单分子提供电场力和 介电泳力， 分别 作为单分子穿过固态纳米孔薄膜 中纳米孔的驱动外场和停留在纳米孔内的捕捉 力； 通过控制介电泳力大于或近似等于电场力以 实现对单分子的减速或捕获。 本发明利用介电 泳， 拓展了纳米孔待测物的测量范围， 并可实现 对单分子的实时可控捕捉、 减速穿孔， 极大提升 探测时间分辨 率。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 114934098 A 2022.08.23 CN 114934098 A 1.一种基于纳米孔器件利用 介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法， 包括如下 步骤： S1、 制作固态纳米孔薄膜； 所述固态纳米孔薄膜包括依次复合的绝缘层 Ⅰ、 导电层和绝 缘层Ⅱ； S2、 制作纳米孔测序装置； 将所述固态纳米孔薄膜作为分隔电解池的正极和负极的隔 膜， 得到所述纳米孔测序装置； S3、 采用所述纳米孔测序装置进行检测； 将待测的单分子加入至所述电解池的负极接 地腔室中； 测试时， 在所述隔膜的两端施加直流电压， 通过所述导电层引入交流电压， 分别 对所述单分子提供电场力和介电泳力， 分别作为所述单分子穿过所述固态纳米孔薄膜中纳 米孔的驱动外场和停留在所述纳米孔内的捕捉力； 通过控制所述介电泳力大于或近似等于 所述电场力， 实现对所述单分子的减速或捕获。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述固态纳米孔薄膜中， 所述绝缘层 Ⅰ为氮 化硅薄膜， 厚度为20～50nm； 所述导电层为钛金薄膜， 厚度为5～10nm； 所述绝缘层 Ⅱ为三氧 化铝薄膜， 厚度为1～ 20nm。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于： 所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径 为5～30nm， 孔深为5 0～80nm。 4.根据权利要求1 ‑3中任一项所述的方法， 其特征在于： 测试时， 所述电解池中盛放有 电解液， 所述电解液为 NaCl溶液、 KCl溶 液或LiCl溶液； 所述电解液的浓度为0.1～3.2mo l/L， pH值 为7～10。 5.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的方法， 其特 征在于： 所述 直流电压为0～1V； 所述交流电压的峰值 为0～1V， 频率 为0.5～2MHz。 6.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的方法， 其特 征在于： 所述单分子为DNA或肽链。 7.一种DNA测试 方法， 包括如下步骤： 采用权利 要求1‑6中任一项所述方法确定使DNA穿孔速度降低所施加的电压和频率； 增 加直流电压从而控制DNA的穿 孔速度， 以解决DNA在固态孔测序中时间分辨 率过低的问题。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934098 A 2一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或 捕获的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方 法， 属于纳米孔单分子 探测技术领域。 背景技术 [0002]基于固态纳 米孔器件的D NA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低 成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线 之一， 是目前研究和应用探索的热点。 从2009年， Clar ke.J等人发现解旋酶修饰的MspA生物 孔可以实现DNA的测序(Nature  Nanotech.4,265 –270,2009)， 到2021年牛津纳米孔公司上 市， 生物纳米孔已经基本实现了DNA的测序。 但还有一些问题没有解决： 解旋酶工作在未知 原因状态下失效导致错误率， 生物孔大小不易调节导致的待测物尺寸限制； 在一些相对极 端的环境中不易保存； 与现代半导体工艺不兼容导致的成本高等。 但对于固态纳米孔来说， 可以控制孔的大小； 孔也可以承受范围更广的温度， 酸碱度， 易保存； 与半导体工艺兼容， 可 以量产这些优势， 继续推动固态纳米孔测序技 术的前进是非常有前 景且具有重大意 义的。 [0003]通过在溶液中电泳驱动分子穿过一个纳米尺度的孔可以实现基于纳米孔器件 的 单分子探测和分析能力。 在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进 行快速的 分析， 当高聚物分子穿过纳米孔时， 高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应 关系。 利用该特性可以直接对 数千碱基对长度的单链DNA分子进 行表征， 避免了扩增或标记 实验准备环节， 使得快速低成本DNA测序技术成为可能。 目前阻碍这一技术长足发展的最大 困难在于在电场驱动电压下， DNA穿孔速度过快， 超出了通用仪器的时间分辨率， 从而无法 实现对单碱基的差别进 行识别。 如何利用固态纳米孔对DNA分子进 行捕获， 对于研究溶液中 对单分子的捕获， 操纵， 控制， 并且研究其化学转化、 分子内部动态变化等生物学过程具有 非常重要的实际意 义。 [0004]目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压， 通过电场驱动， 使 DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔， 在外电路收集的离子电流会出现一个突然 下降， 电流的 突然下降值和阻滞时间， 可以对应DNA的生物学信息。 但是单纯使用电场调节， DNA的穿孔速 度太快， 基本在一个碱基一微秒的量级， 而目前仪器的最小分辨率为4微秒， 也就是说， 如果 想要区别不同碱基之 间的差别， 通过现有手段， 其时间分辨率是无法达到的。 要提高时间分 辨率， 就必须使DNA分子的穿孔时间延长， 有效减慢DNA在孔中的运动速度。 减慢DNA的穿孔 速度， 才有可能实现对不同碱基的分辨。 [0005]另一方面， 现有的第二代高通量测 序技术的基本原理是将待测物种的全基因组随 机打碎成数百bp的小片段， 然后经过体外扩增和修饰标定之后， 利用一种 “边合成边测序 ” 的方法读取每一个小片段 的序列， 最后将全部小片段的序列通过一定的算法整合在一起， 还原出全基因组的序列。 需要指出的是， 每个数百bp的小片段相 对于人类的全基因组(约3 ×109bp)来说实在太小， 因此在小片段的比对和拼接环节的计算量和算法复杂度是极高说　明　书 1/6 页 3 CN 114934098 A 3