ICS 07.080 CCS C 04 DB4403 深 圳 市 地 方 标 准 DB4403/T 122—2020 人源肿瘤细胞系建立技术规范 Technical specification for establishment of human tumor cell lines 2020-11-23 发布 深圳市市场监督管理局 2020-12-01 实施 发 布 DB4403/T 122—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 3 5 样本获取 ........................................................................... 3 6 细胞建系 ........................................................................... 4 7 质量检测 ........................................................................... 6 附录 A（资料性） 捐赠者基本信息表 ..................................................... 9 附录 B（资料性） 肿瘤样本信息表 ...................................................... 10 附录 C（资料性） 主要仪器耗材列表 .................................................... 11 附录 D（资料性） 细胞传代操作流程 .................................................... 13 附录 E（资料性） 同工酶分析操作流程 .................................................. 14 附录 F（资料性） 肿瘤细胞特异性标记物列表 ............................................ 16 附录 G（资料性） 台盼蓝染色标准流程 .................................................. 17 附录 H（资料性） 凝集试验操作流程 .................................................... 19 参考文献 ............................................................................ 20 I DB4403/T 122—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由深圳市发展和改革委员会提出和归口。 本文件起草单位：深圳华大生命科学研究院、深圳市标准技术研究院。 本文件主要起草人：岳建辉、马启旺、樊阳波、李睿、叶晶晶、黎泽龙、何娜、侯勇、王博、张曦、 何旭珩、李启沅、陈振家。 II DB4403/T 122—2020 人源肿瘤细胞系建立技术规范 1 范围 本文件确立了人源肿瘤细胞系建立过程中样本获取、细胞建系以及质量检测的操作程序和一般原 则。 本文件适用于人源实体肿瘤细胞系相关研究。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 18467 献血者健康检查要求 YY/T 0588 流式细胞仪 SZDB/Z 238 短串联重复序列基因分型法鉴定人源细胞系技术规范 ISCN 2013 人类细胞遗传学国际命名体制 ASN—0003—2015 基于线粒体细胞色素氧化酶亚基1（CO1）DNA条形码鉴定动物细胞种属 (Species —Level Identification of Animal Cells through Mitochondrial Cytochrome Oxidase Subunit 1 (CO1) DNA Barcodes） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 供体 donor 提供肿瘤样本的捐赠者。 3.2 原代细胞 primary cell 直接由获取的人体组织或器官制备形成的细胞。 3.3 细胞系 cell line 由原代细胞群经传代培养获得的细胞群。该细胞群通常是非均质的，且具有明确的特性，可供建库 用。 1 DB4403/T 122—2020 3.4 实体瘤 solid tumor 机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致异常增 生而形成的新生物。 3.5 平衡盐溶液 balanced salt solution 组织细胞培养时常用的基本液体，可以维持细胞的渗透压、调节pH值以及提供细胞生存所需的无机 离子成分。 注： 常用于细胞、组织的洗涤。 3.6 密度梯度离心 density gradient centrifugation 用一定的介质（如氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖）在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混 悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离的方法。 3.7 倍增时间 doubling time 在细胞培养过程中，对数期中细胞数量增加一倍所需的时间。 3.8 成瘤性 tumorigenicity 细胞接种动物后在注射部位和（或）转移部位由接种细胞本身形成肿瘤能力。 3.9 染色体 chromosome 遗传信息的载体，由DNA、RNA和蛋白质构成的，其形态和数目具有种系的特性。 注： 在细胞间期核中，以染色质丝形式存在。在细胞分裂时，染色质丝经过螺旋化、折叠、包装成为染色体，为 显微镜下可见的具不同形状的小体。 3.10 同工酶分析 isoenzyme analysis 具有相似或相同特异性的酶，利用琼脂糖凝胶电泳技术，研究细胞裂解过程中同工酶的迁移规律， 以获得具有物种特异性的同功酶谱的过程。 3.11 核型分析 karyotype analysis 2 DB4403/T 122—2020 将待测细胞的染色体按照固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组，并进行形态分析 的过程。 3.12 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。 3.13 流式细胞术 flow cytometry 对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和 分选的技术。 3.14 免疫荧光技术 immunofluorescence technique 将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞分布的方法。 3.15 细胞半数致瘤量 50% tumor producing dose 能使50%动物产生肿瘤的最低移植细胞量。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BPV：牛细小病毒（Bovine parvovirus） CMV：巨细胞病毒（Cytomegalovirus） DMSO：二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide) DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） EBV：人类疱疹病毒四型（Epstein—Barr virus） EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid） HBV：乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus） HCV：丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus） HIV：人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus） HTLV：人类嗜T细胞病毒（Human T—lymphotropic Virus） PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffer Saline） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） PPV：猪细小病毒（Porcine Parvovirus） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） 5 样本获取 5.1 伦理审批和知情同意 3 DB4403/T 122—2020 5.1.1 样本采集前应进行相应的准备工作，严格设计样本采集方案，并按照样本采集方的伦理审查要 求对方案的生物安全、伦理以及科学性进行审查。 5.1.2 样本采集应遵循“知情同意、自愿”的原则。工作人员（包括医生、样本操作技术人员等）应 与捐赠者沟通，详细讲解项目背景、意义，采集的样本量、用途、潜在风险以及捐赠的权利、义务 等，获得捐赠者或者其法定代理人的知情同意。 5.2 信息收集 5.2.1 样本采集前应收集捐赠者信息，包括但不限于姓名、年龄、性别、住院号、病历号等基本信息 及既往病史、家族史、用药史、过敏史等临床信息。捐献者基本信息表参见附录 A。 5.2.2 样本采集后应详细记录所采集的肿瘤样本信息，包括但不限于样本的采集时间、编号、大小、 数量、采集人员等。肿瘤样本信息表见附录 B。 5.2.3 应建立严格有效的样本捐献者信息保护制度，对捐献者健康信息的隐私权加以保护。 5.3 供体筛选 5.3.1 用于肿瘤细胞分离培养的组织应进行筛选，宜排除下列情况的供体： ——病理类型为混合型； ——人源特定病毒检测结果不符合 GB 18467 的规定； ——有精神障碍