ICS 67.080 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2795—2015 苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法 Determination of major phenolic compounds in apple- High performance liquid chromatography 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 ICS 67.080 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2795—2015 苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法 Determination of major phenolic compounds in apple- High performance liquid chromatography 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 ICS 67.080 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2795—2015 苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法 Determination of major phenolic compounds in apple- High performance liquid chromatography 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2795-—2015 4.3.8咖啡酸（CHO4)，纯度≥95%。 4.3.9表儿茶素（CiHO），纯度≥98%。 4. 3. 10 0p-香豆酸（CHgO），纯度≥98%。 4.3.11芦丁（C2H30O16），纯度≥98%。 4.3.12阿魏酸（C1oH／0），纯度≥99%。 4.3. 13 3皮苷（C2H20O1），纯度≥98%。 4.3.14根皮苷（C2H28O12），纯度≥98%。 4.3.15皮素（CsHiO），纯度≥98%。 4.3.16根皮素（C15H14O），纯度≥99%。 4.4标准溶液配制 4.4.12mg/mL单一酚类物质标准储备溶液：分别准确称取酚类物质标准品（4.3）10mg（精确到 0.0001g），于5mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1.3)溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为2mg/mL的 单一酚类物质标准储备溶液。一20℃以下避光贮存，有效期一个月。 4.4.20.1mg/mL酚类物质混合标准中间溶液：分别准确吸取0.1mL单一酚类物质标准储备溶液 （4.4.1）于2mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）稀释至刻度，配置成质量浓度为0.1mg/mL酚类物质混合 标准中间溶液。一20℃以下避光贮存，有效期一周。 4.4.3酚类物质标准工作溶液：分别吸取酚类物质混合标准中间溶液（4.4.2)0.02mL、0.1mL、 0.2mL、0.4mL、1.0mL至2mL棕色容量瓶中，用甲酸一乙睛溶液（4.2.3）定容至刻度，配制成质量浓 度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/L的系列混合标准工作溶液。现配现用。 4.5材料 4.5.1C18固相萃取柱。 4.5.2滤膜：0.45μm，有机相。 5仪器 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 标准信息服务平台 5.2分析天平：感量0.0001g、感量0.01g。 5.3研磨仪。 5.4离心机：转速可达到10000r/min。 5.5漩涡混合器。 5.6旋转蒸发器。 5.7超声波萃取仪：工作频率40kHz，功率500W。 5.8固相萃取器。 5.9圆底烧瓶：100ml。 5.10聚四氟乙烯离心管：50mL。 6试样制备与保存 将苹果样品，用干净纱布轻轻将样品表面擦净，按取样要求取200g样品采用对角线分割法，取对 角部分，将其切碎，充分混均，再用四分法取样，用液氮冷冻后，于研磨仪中研磨成粉末，装人聚乙烯塑料 瓶，一20℃以下保存，备用。 2 NY/T 2795—2015 7分析步骤 7.1提取 称取试样5g（精确到0.01g）于50mL聚四氟乙烯离心管中，加人20mL乙醇溶液（4.2.1），用漩涡 混合器充分混合，室温下超声提取15min，以10000r/min转速、4℃离心10min，上清液倒人50mL棕 色容量瓶中，重复提取1次，上清液合并转入50mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（4.2.1）定容至50mL， 备用。 7.2浓缩 准确吸取10ml样品提取液（7.1)于100mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上减压蒸发至除去乙醇， 温度<40℃，待净化 7.3净化 将C18固相萃取柱放在固相萃取器上，依次用5mL甲醇（4.1.3）和5mL水活化，控制流速1mL/ min。将待净化液（7.2)加人固相萃取柱中，用5mL水清洗旋转蒸发后的圆底烧瓶，加入固相萃取柱 脱液至10mL棕色容量瓶中并定容，过0.45um有机相微孔滤膜，供高效液相色谱测定。 7.4液相色谱参考条件 色谱柱：Ci8色谱柱，4.6mm×250mm，粒径5μm，或相当者； 流动相：A为2%甲酸溶液，B为乙腈，用前过0.45μm滤膜，脱气，梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度洗脱程序（VA+VB） 时间 A B min 0 95 5 30 75 25 45 60 40 50 60 40 51 95 5 60 95 5 柱温：40℃； 流速：0.8mL/min; 检测波长：280nm,320nm,360nm； 进样量：10μL。 苹果中各主要酚类物质在其最佳定量波长下进行检测，各酚类物质的最佳定量波长见附录A。 7.5标准工作曲线 分别吸取10uL标准工作液（4.13)注入高效液相色谱仪，按参考色谱条件测定。以测得峰面积为 纵坐标，对应的标准溶液质量浓度（mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 7.6测定 做3份试料的平行测定，取10μL试样溶液和相应的标准工作溶液在与标准相同的色谱条件下进 行测定，以色谱峰保留时间定性，以色谱峰峰面积定量。标准工作溶液的高效液相色谱图参见附录B。 同时做空白试验，除不称取试料外，均按7.17.3操作步骤进行测定。 8结果计算 苹果中被测酚类物质以质量分数计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1)计算。 3 NY/T2795—2015 AXp. XV. XV2 (1) A, XmXVi 式中： X一试料中某一酚类物质的含量，单位为毫克每千克mg/kg)； -标准工作溶液中某一酚类物质组分的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）； A 试样溶液中某一酚类物质组分的峰面积； A, -标准溶液中某一酚类物质组分的峰面积； Vo 一试料中酚类物质提取液定容体积，单位为毫升（mL）； Vi- 一过C1固相萃取柱所用酚类物质提取液体积，单位为毫升（mL）； V2 -Ci8固相萃取柱净化后定容体积，单位为毫升（mI）； 试料的质量，单位为克（g）； m 计算结果保留三位有效数字。 9精密度 9.1重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。 9.2再现性 在再现性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。 10其他 本标准的定量测定范围：没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、芦丁、阿魏酸、 皮苷、根皮苷和根皮素均为0.25mg/kg~100mg/kg； 儿茶素和皮素均为0.5mg/kg~100mg/kg； 原花青素B1、原花青素B2和表儿茶素均为1mg/kg～100mg/kg 本标准方法的检出限：没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、芦丁、阿魏酸、 皮苷、根皮苷和根皮素为0.12mg/kg，儿茶素和榭皮素为0.25mg/kg，原花青素B1、原花青素B2和表 业标准信息服务平台 儿茶素为0.5mg/kg。 NY/T2795—2015 附录A （规范性附录） 苹果多酚定量波长 苹果多酚定量波长见表A.1。 表A.1 苹果多酚定量波长 定量波长 序号 中文名 CAS号 nn 1 没食子酸 149-91-7 280 2 原儿茶酸 99-50-3 280 3 新绿原酸 906-33-2 320 4 原花青素B1 20315-25-7 280 5 儿茶素 154-23-4 280 6 绿原酸 327-97-9 320 7 原花青素B2 29106-49-8 280 8 咖啡酸 331-39-5 320 9 表儿茶素 490-46-0 280 10 p-香豆酸 501-98-4 320 11 芦丁 153-18-4 360 12 阿魏酸 537-98-4 320 榭皮苷 13 522-12-3 360 （榭皮素一鼠李糖苷） 14 根皮苷 7061-54-3 280 15 榭皮素 6151-25-3 360 16 根皮素 60-82-2 280 行业标准信息服务平台 1