ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2838-2015 禽沙门氏菌病诊断技术 Diagnostic techniques of avian salmonellosis 行业标准信息服务平台 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2838—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：扬州大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：陈素娟、魏荣、彭大新、杨林、陈继明。 行业标准信息服务平台 I NY/T 2838—2015 禽沙门氏菌病诊断技术 1 范围 本标准规定了禽沙门氏菌病诊断技术操作规范， 本标准适用于禽沙门氏菌病的诊断和禽沙门氏菌携带者判定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。 GB4789.42010食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1222—2012禽伤寒和鸡白痢检疫技术规范 世界动物卫生组织（OIE)陆生动物诊断试验和疫苗标准手册（第七版，2012） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DMSO：dimethylsulfoxide，二甲基亚砜 DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸 dNTP：deoxynucleosidetriphosphate，三磷酸脱氧核苷酸 PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应 SPF：specificpathogenfree，无特定病原 TBE:trihydroxymethyl aminomethane-borecic acid-ethylene diaminetetra acetic acid,三羟甲基氨 基甲烷一硼酸一乙二胺四乙酸 EB：ethidiumbromide，溴化乙锭 4培养基和试剂 本方法实验操作中所用各类培养基以及试剂如下： 除另有规定，本方法实验用水应按照GB/T6682中规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。 a) b) 亮绿一胱氨酸一亚硒酸氢钠增菌液、普通营养琼脂、鲜血琼脂、麦康凯琼脂、沙门一志贺菌属 (SS)琼脂、去氧胆酸盐枸橡酸盐琼脂、伊红美蓝琼脂和亮绿中性红琼脂的配制，参见附录A。 缓冲蛋白陈水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC)增菌液、亚硫酸铋 (BS)琼脂、HektoenEnteric(HE)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、三糖铁(TSI)琼脂、 蛋白陈水及靛基质试剂、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养 基、糖发酵管、邻硝基酚β-D-半乳糖苷（ONPG)培养基、半固体琼脂和丙二酸钠培养基的配 制，见GB4789.4一2010附录A。 d) 沙门氏菌O和H诊断血清。 e) 生化鉴定试剂盒。 TaqDNA聚合酶。 电泳缓冲液（TBE）。 g） h）DNA分子量标准品。 NY/T 2838—2015 i）PCR引物。 j）鸡白痢/鸡伤寒多价染色抗原和凝集抗原：见附录B。 k)β 阳性血清：用标准株和变异株鸡白痢沙门氏菌制成的灭活抗原分别接种SPF鸡，采血，分离制 得血清。 1) 阴性血清：SPF鸡采血，分离制得血清。 m）生理盐水。 5设备和器材 本方法实验操作中所用各种设备以及器材如下： a）37℃培养箱；玻璃研磨器或组织匀浆机；台式高速离心机；生物安全柜或者超净工作台；振荡混 匀器；PCR扩增仪；电泳仪；电泳槽；紫外凝胶成像系统；水浴锅；2℃~4℃冰箱；一20℃冰箱。 b）酒精灯；玻璃板或白瓷板；剪刀；镊子；灭菌试管；试管架；滴管；一次性注射器等。可调微量移 液器一套：0.5μL~10μL、20μL~200μL100μL~1000μL，12道可调微量移液器10μL~ 100μL，及与移液器配套的滴头。1.5mLPE管；0.2mLPCR管；96孔U型微量反应板 c）工作服；一次性手套；口罩；帽子等。 6临床诊断 6.1总则 当禽出现6.2至6.4中部分或全部情形时，作为初步诊断的依据之一。 6. 2 流行病学 不同种类、不同日龄的家禽均可感染沙门氏菌，鸡白痢多见于雏鸡，禽伤寒多见于青年鸡或成年鸡。 病禽和带菌禽是本病主要传染源。病原随粪便排出，污染水源和饲料等，经消化道感染。本病还可通过 呼吸道感染，也可经蛋垂直传播。鼠类可传播本病。本病发生无季节性，但多雨潮湿季节多发。一般呈 散发性或地方流行性，应激因素可促进本病的发生。 6. 3临床症状 6.3.1鸡白痢 6.3.1.1雏鸡 垂直传播的维鸡出雏后品质差、发病迅速，1周内为死亡高峰；出壳后感染的维鸡，2周龄～3周龄 为死亡高峰，死亡率可高达100%。最急性者，无临诊症状迅速死亡。稍缓者，精神不振，嗜睡，开始采 食减少或废绝，嗪囊空虚，两翼下垂，绒毛松乱，腹泻，粪便呈石灰样，封肛，发出尖锐叫声，最后因呼吸困 难及心力衰竭而死。引起关节炎时，胫关节肿胀，跛行。引起全眼球炎时，角膜混浊呈云雾状，失明。 耐过鸡生长发育不良，成为慢性病例或带菌者。 6.3.1.2成年鸡 一般无临诊症状，产蛋量与受精率有所下降。极少数病鸡下痢，产蛋下降甚至停止。有的病鸡因卵 黄囊炎引起腹膜炎，腹膜增生出现“垂腹”现象。 6.3.2禽伤寒 维鸡和维鸭发病症状与6.3.1.1相似。 青年鸡及成年鸡易感。急性型病鸡突然停食，排黄绿色稀粪，体温升高至43℃～44℃，拉稀，迅速 死亡，死亡率10%～90%。慢性型可拖延数周，贫血，渐进性消瘦，死亡率低， 6.3.3禽副伤寒 2周龄以内的鸡感染呈败血症经过，突然死亡，症状与6.3.1.1相似。雏鸭感染后表现为颤抖、喘 息及眼脸浮肿。年龄较大的幼禽常取亚急性经过，表现为精神萎靡、闭眼、翅下垂、羽毛粗乱、怕冷、扎 2 NY/T2838—2015 堆、拉稀、脱水、肛门有稀粪，病死率10%～20%，严重者高达80%以上。成年禽一般无临诊症状，为隐 性带菌。 6.4病理变化 6.4.1鸡白痢 6.4.1.1雏鸡 急性病例肝脏呈土黄色，有大量灰白色坏死点。卵黄吸收不良，其内容物色黄如油脂状或干酪样。 病程稍长者，在心肌、肺、肝、肌胃和其他脏器中可见灰白色坏死结节。有的有出血性肺炎，稍大的病维， 肺有灰黄色结节和灰色肝变。胆囊肿胀。盲肠中有干酪样渗出物堵塞肠腔，有时还混有血液，常有腹膜 炎。输尿管充满尿酸盐而扩张。育成阶段的鸡肝肿大，呈暗红色至深紫色，表面可见散在或弥漫性的出 血点或黄白色大小不一的坏死灶，质地脆，易破裂，常见有内出血变化，腹腔内积有大量血水，肝表面有 较大的凝血块。 6.4.1.2成年鸡 成年母鸡最常见卵子变形、变色、变质。与卵巢相连的卵子内容物色黄如油脂状或干酪样，卵黄囊 增厚。有些卵子经输卵管逆行坠人腹腔，引起广泛的腹膜炎及腹腔脏器粘连。常有心包炎。成年公鸡 的睾丸极度萎缩，有小脓肿，输精管管腔增大，充满稠密的均质渗出物。 6.4.2禽伤寒 维禽病理变化与6.4.1.1相似。 成年鸡急性型常见肝、脾、肾充血肿大。亚急性和慢性型表现肝肿大，呈青铜色。肝和心肌有灰白 色粟粒状坏死灶，大小不等。脾肿大，可达正常的2倍～3倍，出血，表面有坏死点。小肠出血严重，有 时可见溃疡灶。慢性型卵子及腹腔的病理变化与6.4.1.2相似。 6.4.3禽副伤寒 6.4.3.1维禽 维鸡卵黄吸收不良和脐炎。肝脏轻度肿大，病程稍长的肝脏充血并有条纹状出血和灰白色坏死灶。 盲肠内有干酪样渗出物。有时有心包炎及心包粘连。肠道发生出血性、卡他性炎症。维鸭肝脏显著肿 大或呈青铜色，有灰白色坏死灶。 6.4.3.2成年鸡 急性型肝、脾、肾充血肿胀，有出血性坏死性肠炎、心包炎，输卵管坏死增生，卵巢坏死化脓，形成腹 膜炎。慢性型和带菌者一般无明显病变，有的可见肠道变性、坏死性溃疡，心脏有结节，卵子变形。 7细菌分离培养 7.1样品采集 无菌采集存活禽的新鲜粪便、泄殖腔棉拭样品；病死或带菌禽的肝脏、胆囊、脾脏及其他病变组织， 盲肠扁桃体及肠内容物。 7.2样品的保存 样品均放人4℃冰箱内保存，并在24h内送到指定实验室。如果在24h内不能送达的，应将组织块 剪碎加人无菌的终浓度为50%甘油生理盐水或15%二甲基亚砜（DMSO)PBS，与样本混匀后放一20℃ 或一70℃冰箱保存。 7.3培养方法 7.3.1非污染样品 取组织器官和胆囊内容物，无菌条件下在非选择性琼脂平板（普通琼脂平板或鲜血琼脂平板）和选 择性琼脂平板（麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、SS琼脂、去氧胆酸钠一枸橡酸盐琼脂、HE琼脂、木糖赖氨 酸脱氧胆酸钠琼脂、亚硫酸铋BS琼脂或亮绿中性红琼脂等）上使用接种环三区划线培养，同时将组织 3 NY/T2838—2015 器官均浆，1：10的体积接种缓冲蛋白陈水，37℃培养24h，之后再按1：10的体积转接增菌培养液（四 硫磺酸钠煌绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液或亮绿一胱氨酸一亚硒酸氢钠增菌液），培养24h和48h 后，再在选择性琼脂平板传代。 7.3.2污染样品 将泄殖腔棉拭、新鲜粪便、盲肠扁桃体、肠内容物等样品（非液体性样品先制成匀浆液），按1：10的 体积接种缓冲蛋白陈水，37℃培养24h，之后再按1：10的体积转接增菌培养液（四硫磺酸钠煌绿增菌 液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液或亮绿一胱氨酸一亚硒酸氢钠增菌液），培养24h和48h