ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2839-2015 致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定技术 Isolation and Identification of Escherichia coli Causing Piglet's Yellow Dysentery 行业标准信息服务平台 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2839—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。 本标准主要起草人：陈义平、郭玉广、南文龙、高崧、成大荣、杜元钊、高清清、马爽、程增青。 行业标准信息服务平台 I NY/T2839—2015 引 言 仔猪黄痫是由致病性大肠杆菌引起的以初生仔猪下痫为特征的传染病。该病主要引起7日龄以内 的仔猪发病，特征是排出黄色水样粪便以及渐进性死亡，病死率达30%以上，甚至全窝死亡，是影响仔 猪成活率的主要疾病之一。根据仔猪的发病日龄和临床症状可以初步做出诊断，但是确诊则需要对致 病菌株进行分离鉴定。因此，进行致仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定，对仔猪黄痫的防治具有重要意义。 本标准制定了致仔猪黄痫大肠杆菌的病料采集、病原菌分离及鉴定方法。 行业标准信息服务平台 Ⅱ NY/T2839—2015 致仔猪黄大肠杆菌分离鉴定技术 1范围 本标准规定了致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定的操作程序和判定标准。 本标准适用于致仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB4789.38一2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 SN/T0169—2010进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法 中华人民共和国农业部公告【2003]第302号兽医实验室生物安全技术管理规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件： V-P:乙酰甲基甲醇试验Voges-Proskauerreaction PCR：聚合酶链式反应Polymerasechainreaction PBS：磷酸盐缓冲液Phosphatebuffersaline SPF：无特定病原微生物Speceficpathogenfree DMEM:培养基Dulbecco's Modification of Eagle's Medium PEG:聚乙二醇Polyethyleneglycol HAT：含黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）的DMEM HT：含黄嘌呤（hypoxantin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）的DMEM dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸deoxyribonucleosidetriphosphates 隹信息服务平 bp:碱基对basepair TBE：Tris-硼酸电泳缓冲液 r/min:转/分钟rotationsperminute min:分钟minute h:小时hour 4试剂 4.1麦康凯、大豆陈琼脂、Minca、Slanetz等培养基：制备参见附录A。 4.2葡萄糖发酵、吲哚、甲基红、V-P、枸橡酸盐利用等生化试验管：制备参见附录B。 4.3兔抗K88、K99、987P、F41菌毛阳性血清及阴性对照兔血清：制备参见附录C。 4.4K88、K99、987P、F41菌毛特异性单克隆抗体及阴性对照鼠血清：制备参见附录D。 5器材 超净工作台、恒温培养箱、酒精灯、接种环、手术刀、玻璃板或载玻片、微量移液器（10μL、20uL、 NY/T 2839—2015 200 μL,1 000 μL)。 6病料样品的处理 6.1病料样品采集：仔猪黄痢多发于7日龄以内仔猪，发病仔猪不愿吃奶，拉黄痢，多呈黄色水样，内含 凝乳小片，后肢常被粪液。发病严重的仔猪很快消瘦，最后衰竭死亡。胃肠呈卡他性炎症，病变主要表 现为胃黏膜红肿，肠黏膜肿胀、充血或出血，肠系膜淋巴结肿大。 采集疑似病例的肛拭子或肠道（十二指肠、空肠、回肠）作为细菌分离用病料。 6.2病料样品的存放与运送：病料样品置2℃～8℃条件下保存，并在3d内进行细菌分离。如果超过 3d，应置含10%甘油的0.01mo1/LpH7.4PBS中，一15℃以下暂时保存，并尽快进行细菌分离。运输 时确保低温运送，并及时送达，以防样品腐败。按照中华人民共和国农业部公告[2003】第302号的规定 进行样品的生物安全标识。 7致仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定方法 7.1细菌分离与纯化：将肠道病料置超净工作台中，固定，手术刀片火焰灼烧后，烙烫肠道浆膜层消毒， 无菌打开肠腔，接种环灼烧消毒，冷却后伸人肠道，刮取病变部位肠道黏膜，划线接种于麦康凯培养基。 或取肛拭子直接接种于麦康凯培养基。37℃培养18h～24h，挑取疑似菌落（菌落呈鲜红色或粉红色， 极少数呈无色，中等大小，1.0mm～2.5mm，圆形，边缘整齐，表面光滑），纯化后进行以下试验。 7.2生化特性鉴定：取纯化菌落分别接种葡萄糖发酵、吲哚、甲基红、V-P、枸橡酸盐利用生化试验管， 参见附录B进行，观察并记录结果。 7.3菌毛型鉴定：以下两种方法可任选其一。 7.3.1玻板凝集试验：取菌落分别接种于大豆陈琼脂、Minca培养基、Slanetz培养基，37℃培养18h～ 24h，取各培养基上菌苔与适量生理盐水制成均匀混悬液（浊度与麦氏比浊管第三管相当）。参见附录 E方法，将菌苔混悬液分别与不同的单克隆抗体或阳性血清进行玻板凝集试验： 大豆陈琼脂培养基上生长的菌苔制成的混悬液，与大肠杆菌K88菌毛特异性单克隆抗体或阳 性血清进行玻板凝集试验，3min～5min后观察结果； 或阳性血清进行玻板凝集试验，3min~5min后观察结果； -Slanetz培养基上生长的菌苔制成的混悬液，与大肠杆菌987P菌毛特异性单克隆抗体或阳性 血清进行玻板凝集试验，3min~5min后观察结果； 同时取菌苔混悬液与生理盐水以及相应的阴性对照血清分别进行玻板凝集试验，作为阴性对 照，3min～5min后观察结果。 如果菌苔混悬液与生理盐水以及相应的阴性对照血清均不发生凝集，则试验成立。观察菌苔混悬 液与特异性单克隆抗体或阳性血清的凝集情况，出现凝集，结果判为相应菌毛型阳性；如无凝集，则传代 后重新检测，传代三次仍然未出现凝集，则判为相应菌毛型阴性。 7.3.2菌毛型的PCR鉴定：挑取单个疑似菌落，重悬于100μL灭菌去离子水中，煮沸5min，作为样品 DNA模板。分别用K88、K99、987P、F41菌毛型特异性引物进行PCR扩增，同时设立相应的阴、阳性对 照。具体试验方案及操作程序参见附录F。 如作为阳性对照的大肠杆菌K88、K99、987P、F41菌毛型菌株的DNA模板经PCR扩增后，分别出 现841bp、543bp、463bp、682bp大小的扩增条带，且阴性对照未出现扩增条带时，试验成立。被检样 8结果判定 2 NY/T2839—2015 果判定为致仔猪黄大肠杆菌阴性： 可在麦康凯培养基上生长，菌落颜色为红色（极少数为无色菌落）； -可发酵葡萄糖，吲哚、甲基红试验均呈阳性反应，V-P试验、枸橡酸盐利用试验均呈阴性反应； -能和大肠杆菌K88、K99、987P、F41特异性单克隆抗体或阳性血清中的至少一种发生凝集反 应；或者大肠杆菌K88、K99、987P、F41菌毛型PCR鉴定时，至少一种为阳性。 9废弃物与病料处理方法 废弃物处理参照中华人民共和国农业部(2003]第302号的规定进行。 10注意事项 10.1所有操作应严格遵守生物安全规定。 10.2玻板凝集试验可以在玻璃板上进行，样品较少时也可以在载玻片上进行。 10.3试验时，若采用商品化的培养基、生化试验鉴定管、特异性抗体等试剂，可根据说明书进行操作及 结果判定。 行业标准信息服务平台 8 NY/T 2839—2015 附录A （资料性附录） 培养基的配制 A.1大豆陈琼脂培养基 胰蛋白陈 17.0 g 大豆蛋白陈 3.0 g NaCI(分析纯) 5.0 g KH,PO（分析纯） 2.5 g 2.5 g 葡萄糖（分析纯） 琼脂粉 12.0g 先称取除琼脂粉以外的其他试剂，加入约800mL双蒸水，溶解后调pH至7.4。再加人琼脂粉并 加热溶解，定容至1000mL，115℃高压灭菌15min，制成平板，置2℃~8℃备用。 A.2Minca培养基 A.2.1微量盐溶液 MgSO·7H2O（分析纯） 10.0 g MnCl2·2H,O(分析纯） 1. 0 g FeCl：·6H2O（分析纯） 0.135 g CaCl2（分析纯） 0. 4 g 加双蒸水至1000mL，115℃高压灭菌15min，置2℃~8℃备用。 A.2.2Minca培养基 KH2PO（分析纯） 1.36 g NaHPO,·12H,O(分析纯） 20.3 g 酪蛋白氨基酸 1. 0 g 1.0 g 葡萄糖(分析纯) 微量盐溶液 1 mL 琼脂粉 12.0 g 先称取除琼脂粉以外的其他试剂.加入约800mL双蒸水，溶解后调pH至7.5。再加人琼脂粉并 加热溶解，定容至100