ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2859—2015 主要农作物品种真实性SSR 普通小麦 分子标记检测 Variety genuineness testing of main crops with SSR markers- Wheat (Triticum aestivum L.) 行业标准信息服务平台 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2859—2015 目 次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 缩略语 5 总则· 检测方案 6 仪器设备、试剂和溶液配制 8 真实性检测程序 9结果计算与表示 10结果报告 10 附录A(规范性附录) 溶液配制 11 附录B(资料性附录) 引物分组信息 13 附录C(规范性附录) 等位变异扩增片段信息 附录D(资料性附录) 参照样品名单… 23 行业标准信息服务平台 NY/T2859—2015 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容有可能涉及专利。本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部种子管理局提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心、全国农业技术推广服务中 心、北京市种子管理站。 本标准主要起草人：赵昌平、支巨振、邱军、庞斌双、刘丽华、王立新、谷铁城、刘丰泽、吴明生、刘阳 娜、张立平、张风廷、李宏博、赵海艳。 行业标准信息服务平台 NY/T2859—2015 主要农作物品种真实性SSR分子标记检测普通小麦 1范围 本标准规定了利用SSR分子标记法进行普通小麦（TriticumaestiuumL.）常规品种真实性检测的 原则、检测方案、检测程序和结果报告。 本标准适用于普通小麦常规品种真实性验证和品种真实性身份鉴定，不适用于实质性派生品种 (EDV)和转基因品种的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T3543.1农作物种子检验规程总则 GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样 GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 品种真实性验证 varietyverification 与其对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称与标注是否相符。 3. 2 品种真实性身份鉴定varietyidentification 经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台（见3.4）筛查比较，确定供检样品的 真实品种名称。 3. 3 标准样品standardsample 国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。 3. 4 SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并运用计算机数据库技术和网 络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体。 3.5 参照样品referencecontrol sample 用于校准供检样品SSR等位变异已定义扩增产物片段大小的样品。 3. 6 引物primer 一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3'-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成 模板DNA的互补链。 1 NY/T2859—2015 3.7 组合引物panel 具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标 记引物。 3. 8 核心引物coreprimer 以最少数量的引物最大限度地区分普通小麦品种的一套引物。 3. 9 扩展引物extendedprimer 辅助真实性检测的一套引物。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:basepair碱基对 CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵 DNA:deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸 dNTPs:deoxy一ribonucleosidetriphosphates脱氧核苷三磷酸 PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR：polymerasechainreaction聚合酶链式反应 SDS:sodiumdodecyl sulfate十二烷基磺酸钠 SSR：simplesequencerepeat简单序列重复 Taq酶：Taq-DNApolymerase耐热DNA聚合酶 5总则 普通小麦的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列（SSR）的重复次数差异。 这种差异可以通过从抽取有代表性的供检样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，从而利用扩 增片段大小不同而加以区分品种。 依据SSR标记检测原理，采用固定数目的SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对 平台比对的方式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据规定数目引物的SSR位点差异 数目而判定，品种真实性身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定。 6检测方案 6.1总则 对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。应 依据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的引物、检测平台、样品状况，制 订相应的检测方案。 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。 6.2检测平台 6.2.1电泳是检测的关键环节。对于品种真实性验证或身份鉴定，可选择采用变性PAGE垂直板电 泳或毛细管电泳，如需要利用SSR指纹数据比对平台，则需要利用参照样品确定供检样品的指纹后再 2 NY/T2859—2015 进行真实性身份鉴定。 6.2.2对于供检样品量较大的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、多引物组合的毛细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率。 6.2.3DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按 照检测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的局部改进。 6.3引物 6.3.1 经对我国审定小麦品种进行SSR标记测试后，本文件遵选了42对SSR引物作为品种真实性验 证和身份鉴定的检测引物，具体见表1和表2，并据此构建了已知品种的SSR指纹数据比对平台。表1 为核心引物，编号为PM01～PM21，表2为扩展引物，编号为PM22～PM42，每组包含21对引物。 表1核心引物信息 染色体 退火温度 编号 引物名称 引物序列（5'-3'） （位置） ℃ F:TCATTGGTGTCATCCCTCGTGT PM01 cwm65 1A 65 R:GAATAATGCCTTGACCCTGGAC F:GCGAATTAGCATCTGCATCTGTTTGAG PM02 barc80 1BL 65 R:CGGTCAACCAACTACTGCACAAC F:CTCCTTGGAATCTCACCGAA PM03 cfd72 1DL 60 R:TCCTTGGGAATATGCCTCCT F:GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG PM04 gwm294 2AL 55 R:GCAGAGTGATCAATGCCAGA F:TTGTACATTAAGTTCCCATTA PM05 gwm429 2BS 55 R: TTTAAGGACCTACATGACAC F:CTCCCTGTACGCCTAAGGC PM06 gwm261 2DS 55 R:CTCGCGCTACTAGCCATTG F:CAATCATTTCCCCCTCCC PM07 gwm155 3AL 55 R;AATCATTGGAAATCCATATGCC F:ATGACCCTTCTGCCAAACAC PM08 gwm285 3BS 65 R:ATCGACCGGGATCTAGCC F:TGGTTTTCTCGAGCATTCAA PM09 gdm72 3DS 55 R:TGCAACGATGAAGACCAGAA F:CTGCCTTCTCCATGGTTTGT PM10 4AS gwm610 65 R:AATGGCCAAAGGTTATGAAGG F:GGAGAGGATAGGCACAGGAC PM11 ksum62 4B 60 R:GAGAGCAGAGGGAGCTATGG F:TTCCCATAACGCCGATAGTA PM12 barc91 4DL 55 R:GCCTTTAATATTAGCTTCAAGATCAT F:AGGAAACAGAAATATCGCGG PM13 gwm304 5AS 55 R:AGGACTGTGGGGAATGAATG F:ACCACACAAACAAGGTAAGCG PM14 gwm67 5BL 60 R:CAACCCTCTTAATTTTGTTGGG F:GGTTGTCAGGCAGGATATTTG PM15 cfd29 5DL 65 R:TATTGATAGATCAGGGCGCA F:AATTTCAAAAAGGAGAGAGA PM16 gwm459 6AS 55 R:AACATGTGTTTTTAGCTATC F:CGCTGAAAAGAAGTGCCGCATTAT