ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2841-2015 猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法 Method of detecting transmissible gastroenteritis virus by RT-nPCR 行业标准信息服务平台 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2841—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会归口（SAC/TC181）。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、东北农业大学、河南农业大学、河南牧业经济 学院。 本标准起草人：邵卫星、魏荣、李晓成、李一经、黄耀华、魏战勇、徐耀辉、吴发兴、张志、刘爽、董亚琴、 孙映雪、李卫华、王树双、黄保续。 行业标准信息服务平台 I NY/T2841—2015 猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法 1范围 本标准规定了检测猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR方法的技术要求。 本标准适用于检测疑似感染猪传染性胃肠炎病毒的猪的新鲜粪便、小肠组织及肠内容物和细胞培 养物中的猪传染性胃肠炎病毒的核酸，可作为猪传染性胃肠炎的辅助诊断方法和细胞培养物中猪传染 性胃肠炎病毒的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。 3缩略语 下列缩略语适用于本文件： AMV：禽成髓细胞瘤病毒avianmyeloblastosisvirus RT-nPCR：反转录一巢式聚合酶链式反应reversetranscriptase-nestedpolymerasechainreac tion RNA：核糖核酸ribonucleic acid DEPC：焦碳酸二乙酯diethypyrocarbonate PBS：磷酸盐缓冲液（配方见附录A.1）phosphate-bufferedsalinebuffer Taq酶：TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸deoxyribonucleosidetriphosphates bp:碱基对basepair 4试剂 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的灭菌双蒸水或超纯水。提取 RNA所用试剂均须使用无RNA酶水配制：分装的容器需无RNA酶。 4.1磷酸盐缓冲液：配方见附录A.1。 4.2 RNA提取试剂：Trizol LS。 4.3氯仿（警告：危险）。 4.4异丙醇。 4.575%的乙醇。 4.6DNA分子量标准：DL2000。 4.7AMV反转录酶及反应缓冲液。 4.8 dNTPs Mixture. 4.9RNA酶抑制剂（40U/μL）。 4.10 rTaq mix。 4.11反转录及PCR扩增引物：见附录B。 1 NY/T 2841—2015 4. 12 无RNA酶超纯水。 4. 13 1.5%琼脂糖：配方见A.3。 4.14电泳缓冲液（TAE）：配方见A.4。 4. 15 样品处理液：配方见A2。 4.16 阳性样品：参见C.1。 4.17 阴性样品：参见C.2。 5仪器设备 5.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000xg以上。 5.2PCR扩增仪。 5.3核酸电泳仪和水平电泳槽。 5.4恒温水浴锅。 5.52℃~8℃冰箱和-18℃冰箱。 5.6微量加样器（0.5μL~10μL2μL~20μL，20μL~200μL，100μL1000μL）。 5.7组织研磨器或研钵。 5.8凝胶成像系统(或紫外透射仪)。 6样品的采集、运输和处理 6.1样品采集和运输 宜采集腹泻急性期的小肠或新鲜粪便。采集小肠（5cm10cm）或新鲜粪便（5g～10g），置于样品 密封袋中，在低温保存箱中送实验室，应确保样品到实验室时附带的冰袋未完全融化；如不能及时检测， 应将样品置于低于一18℃冰箱中保存。 6.2样品处理 6.2.1小肠样品 取1cm～3cm小肠组织，用剪刀剪碎，加人10mL的PBS。用组织研磨器研磨后反复冻融3次，经 12000r/min离心5min，取上清备用。 6.2.2粪便样品 取0.5g~1.0g新鲜粪便，加人800μL样品处理液。反复冻融3次，经12000r/min离心5min，取 上清备用。 6.2.3细胞培养物样品 7RNA的提取 下列方法任选其一。在提取RNA时，应设立阳性对照样品和阴性对照样品，按同样的方法提取 RNA。RNA的提取宜在无RNA污染的外排式生物安全柜中进行。 a）Trizol法。按照生产厂家提供的操作说明进行，步骤如下：取250uL上清作为待提取样品。 加入750μlTrizol，振荡混匀后，室温放置5min。加人氯仿250μL，振荡混匀后，室温放置5 min～15min，4℃12000r/min离心15min。取上层水相400μL～500μL，加人等体积的异丙 醇，混匀，一20℃放置2h以上或一80℃放置0.5h，4℃12000r/min离心10min。去上清，缓 缓加人75%乙醇（用DEPC水配制）1.0mL洗涤，4℃12000r/min离心5min。去上清，室温 干燥20min，加入DEPC水20μL，使充分溶解。 2 NY/T 2841—2015 b）选择市售商品化RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明进行RNA的提取。 8 RT-nPCR程序* 8.1 反转录(RT) 8.1.1RT反应体系(20μL体系) 参见附录D.1。 8.1.2RT反应程序 室温放置5min，42℃水浴1h，70℃15min，冰浴5min。取出后可以直接进行PCR，或者放于 一20℃保存备用。试验中，同时设立阳性对照和阴性对照。 8.2第一轮 PCR扩增 8.2.1PCR体系(20μL体系) 参见 D. 2。 8.2.2PCR程序 94℃预变性5min后进入PCR循环，94℃变性30s，60℃退火30s72℃延伸90s，20个循环，最后 72℃终延伸10min，结束反应。同时，设阳性对照和阴性对照。 8.3第二轮PCR扩增 8.3.1PCR体系(20.0μL体系) 参见 D.3。 8.3.2PCR程序 95℃预变性5min后进人PCR循环，94℃变性20s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后 72℃终延伸10min，结束反应。 9电泳 9.1制备1.5%琼脂糖凝胶板。 9.2取第二轮PCR扩增产物5.0μL，加人琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时加人DNA分子量标准作 对照。 9.3盖好电泳仪盖子，插好电极，电压为10V/cm~20V/cm，时间为30min。 9.4用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档。 9.5与DNA分子量标准进行比较，判断PCR片段大小。 10结果判定 10.1试验成立的条件 阳性对照有210bp的特异扩增条带，阴性对照没有相应条带，否则试验不成立。 10.2样品检测结果判定 在阳性对照、阴性对照都成立的前提下，若检测样品有210bp的条带，则判定该样品中猪传染性胃 肠炎病毒阳性；若检测样品没有210bp的条带，则判定该样品中猪传染性胃肠炎病毒为阴性（参见附录 E)。在需要的情况下，可对扩增的条带进行回收，克隆到T载体，进行测序，所得序列与GenBank上的 猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列进行同源性比较，以进一步验证PCR检测结果。 可以将反转录和第一轮PCR扩增合并在一个管中进行反应，即所谓的反转录和PCR一步法。反应体系可按试剂生产商提供的 进行；反转录条件可按试剂生产商提供的进行，但PCR条件宜根据8.2.2PCR程序进行。 3 NY/T 2841—2015 附录A （规范性附录） 溶液的配制 A. 1PBS 液(0. 01 mol/ L PBS,pH 7. 4) 0. 20 g 磷酸二氢钾（KH,PO） 2. 90 g 磷酸氢二钠（Naz2HPO4·12H2O) 8. 00 g 氯化钠（NaCI） 0. 20 g 氯化钾(KCI) 蒸馏水 加至1000.00mL 溶解后，调节pH至7.4，保存于4℃备用。 A.2样品处理液(200mL) 1.6g 氯化钠(NaCI) 氯化钾(KCI) 0. 04 g 0. 288 g 磷酸氢二钠（Na2HPO·12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO) 0. 048 g 乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA·2H2O) 3. 722 4 g 加去离子水定容至200mL，121℃灭菌25min后备用。 A.31.5%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1. 5 g 1XTAE电泳缓冲液 加至100mL 微波炉中完全融化，待冷至50℃～60℃时，加溴化乙锭（EB)溶液或其他替代染料5μL，摇匀，倒人 标准信息服务 电泳板上，凝固后取下梳子，备用。 A.4电泳缓冲液 50XTAE核酸电泳缓冲液（250mL）： Tris 60.5g 冰醋酸 14. 3 mL 9.3g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O) 4 NY/T2841—2015 附录 B （规范性附录） 检测猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR方法的引物序列 检测猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR方法的引物序列见表B.1。 表 B. 1 引物名称 引物浓度 引物序列 F1 10 pmol/μL 5'-GGGTAAGTTGCTCATTAGAAATAATGG-3' R1 10 pmol/μL 5'-CTTCTTCA