ICS 65.020 B16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2864—2015 葡萄溃疡病抗性鉴定技术规范 Technical specification for evaluation of grape resistance to grapevine dieback 行业标准信息服务平台 2015-12-29发布 2016-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2864—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510）归口。 本标准起草单位：北京市农林科学院。 本标准主要起草人：李兴红、燕继晔、张玮、严红、乔广行。 行业标准信息服务平台 I NY/T2864—2015 葡萄溃疡病抗性鉴定技术规范 1范围 本标准规定了葡萄抗溃疡病（grapevinedieback）鉴定方法和评价方法。 本标准适用于葡萄（VitisL.）抗溃疡病的室内鉴定及抗性评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 葡萄溃疡病grapevinedieback 由葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaecae）真菌引起的葡萄真菌性病害。 注：病原菌危害果穗和枝条，果实在转色期表现症状，穗轴出现黑褐色病斑，向下发展引起果梗干枯致使果实腐烂脱 落或干缩；危害枝条引起溃疡斑，有时病斑上着生许多黑色小点，严重时还可造成整个植株枯死。该病在我国主 要由可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae和葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea引起。 3.2 分生孢子器 真菌的一种无性子实体，由菌丝体构成，近圆形，顶部有一小孔口，内壁生有许多短小的分生孢子 梗，梗上长有分生孢子。 3.3 抗性评价evaluation ofresistance 根据采用的技术标准判别植物寄主对特定病虫害反应程度和抵抗水平的描述。 4试剂与材料 除非另有说明，本规范所用试剂均为分析纯，水为CB/T6682规定的三级水。 4.1马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基 马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。将马铃薯去皮、切成小块，用水煮沸30min，纱布过滤，加人 葡萄糖和琼脂粉，滤液定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。 4.22%水琼脂培养基(WA)培养基 琼脂20g，用水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。 5仪器设备 5.1恒温培养箱 温度范围：0℃~50℃，温度波动：土1℃。 5.2光学显微镜 NY/T2864—2015 目镜：10×；物镜：10×，40×。 5.3超净工作台 洁净等级：100级0.5um，平均风速：0.25m/s~0.6m/s。 5.4高压灭菌锅 温度范围：0℃~135℃，灭菌时间范围：4min~120min，最高工作压力：0.22MPa~0.25MPa。 5.5干热灭菌箱 温度范围：室温+10℃~250℃，温度波动：土1℃。 6接种体制备 6.1病菌分离纯化、保存 PUBL 6.1.1病原菌分离培养 从葡萄枝干病斑边缘 cm的病组织3块~ XO 5块，用75%乙醇溶液消毒90 然成用灵 水吸 置于直径为9cm 的PDA平板上，每个 平板 恒温培养箱中（28土 1)℃培养。 RE 6.1.2病原菌纯 培界基 病菌分离物培养 d 从生长的菌落边缘挑取生 量菌丝转人新的PD Od~15d左 右，菌落表面开始 分生孢 子器，将分生包六器转利 的载玻片 形 醇溶液消毒处 上，用解剖刀 将分生孢子器破碎 转移至 含有1m/无菌水的1. 离心管中，充分混勾后 层擦镜纸过滤到 个新的1.5mL 离心 使用血球计数板计算地子 水菌水配成每毫升合 100 农 个孢抱子的悬浮 液，吸取100μl 孢 均匀涂 指培 基上在超净工作台中 28 1℃条件 下培养至分生孢子 有发 目镜： 孢子置于 新的PDA培养基 县分离菌未产生分 包子，则 在水琼脂培养 存备用 CENT 基上培养1d，挑取单 菌 注：所有试材均需灭 6.1.3病原菌保 存 6.1.3.1滤纸片保存 将剪至0.5cm 天袋以 纸袋湿热灭菌2次（ 及牛 将待保存菌 株接种在PDA培养基 温培美至草丝 长过 产生分生孢子器 后，用镊子将滤纸片揭下 硫酸 中将装有带菌滤纸片 酸纸袋装人牛皮纸 袋，在超净工作台中吹干，密 温保存。 装有硅 在一20° 6.1.3.2石蜡油保存 将石蜡油湿热灭菌2次，干热火菌1 制作PDA试管斜面将待保存菌株接种至斜面，待长满斜 面时将石蜡油加入试管中没过斜面约1cm常温保存 6.2病原菌鉴定 依据病原菌形态和部分基因序列对接种用的菌株进行鉴定。可可毛色二孢（Lasiodiplodiatheo bromae）鉴定方法参见附录A，葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）鉴定方法参见附录B。 6.3接种体制备 将保存的菌株转接于PDA培养基上，（28土1）℃恒温培养箱中培养3d，在菌落离培养血边缘处用 灭菌的5mm打孔器打菌饼备用。 室内抗性鉴定 7.1培养室 2 NY/T2864—2015 培养室要求可控温、控湿和光照调控，以满足接种后植株所需的发病条件。 7.2对照品种 抗病葡萄品种为峰后和美人指”；感病葡萄品种为红地球和玫瑰香”；高感葡萄品种为“夏黑” 和维多利亚等。 7.3鉴定设计 鉴定材料随机排列或顺序排列，每个鉴定材料重复3次，每个重复设10个枝条。 7.4接种材料 选取健康的半木质化葡萄新梢，枝 条生长期间禁用化学农药，取新梢基部以上30cm~35cm包含4 节～5节的梢段作为接种材料 7.5接种方法 采用刺伤接种方 菌打孔器打孔，去除韧皮部，取6.3中制 7.6接种后的 用枝剪将接种 后的新悄 带形修剪，插入装有 体中， 放置于培养室中培养， 光照25℃，黑暗 ℃交替 h、相对 6以 奇蛭石湿 7.7调查 方法 接种后每 害发生情况，在接种后第10d测量病斑的长度不 调查记录参见附录C。 8抗性评价 A 8.1鉴定有 分别选 用抗润品种（?峰 人指”）、感病晶种红地球、玫瑰香 利亚）为对！ 品种 该批次葡萄溃疡病抗 病性鉴定视为有效。 当对照感内品种表现为感病目 8.2 统计分 析方法 C 对调查所 方法对品种进行聚类 绘制聚类谱系 8.3抗性划分 根据鉴定材料的病斑 类，与对照抗病品种聚 在一类的试验品种为抗病品 病品种聚在 感病品种 寸照高感品种聚在一类的为 高感品种。 服务平台 小 NY/T2864—2015 附录A (资料性附录） 可可毛色二孢（Lasiodiplodiatheobromae）鉴定方法 A.1学名和形态学描述 A.1.1学名 可可毛色二孢（Lasiodiplodiatheobromae） A.1.2形态描述 在PDA培养基上具有灰棕色至黑色的致密气生菌丝。分生孢子器球型，聚生，深棕色，单腔，厚或 者薄壁，壁由深棕色厚壁的角质化组织构成。分生孢子梗简化为产孢细胞，产孢细胞无色，光滑，圆柱状 至近倒梨形。分生孢子长圆形，直，最初为无色、无隔，并保持很长一段时间，最终变为深棕色和具有不 规则经向纹饰的单隔，顶部广圆，基部平截。分生孢子大小为（20~）24~28（~33）μm×（10~）1215 (~18) μm。 A.2分子生物学鉴定 将待提DNA的葡萄溃疡病菌菌株置于PDA培养基上，28℃下，光暗交替培养5d，后用灭菌牙签 刮取培养基表面菌丝，收集到灭菌的1.5mL离心管中，采用CTAB法提取菌株基因组DNA。以上述 基因组DNA为模板，分别以引物对ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b和EF1-728F/EF1-986R（序列见表A.1） 扩增ITS、β-tubulin和EF1-α基因。PCR反应总体系为25μL，各组分如下：10XPCRreactionbuffer 2.5μL,10mMdNTP0.5μL.正反引物（浓度为10mM）各0.5μL，1UExTaqDNA聚合酶0.25μL， 模板DNA10ng~20ng，用ddHzO补至25uL。ITS和β-tubulin基因PCR的反应条件一致，为94℃ 2min预变性；94℃变性60s.退火58℃60s，72℃90s，35个循环；72℃10min。EF1-α的扩增条件为 95℃3min预变性；95℃变性30s，退火55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min。 表A.1菌株鉴定所用引物序列 目标基因 引物名称 引物序列 ITSI 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ITS ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' Bt2a 5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3 β-tubulin Bt2b 5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3 EF1-728F 5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGC3 EF1 - α EF1-986R 5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3' 扩增产物用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像仪观察，切胶回收日的基因扩增产物，片 段连入PMD18-T载体，由公司进行序列测定，获得的序列在NCBI数据库中进行初步比对分析。 分别将同一菌株的ITS.β-tubulin和EF1-α基因序列整